Mae metabolion imiwno-fodiwlaidd yn nodwedd allweddol o ficroamgylchedd y tiwmor (TME), ond gydag ychydig o eithriadau, mae eu hunaniaethau'n parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth. Yma, dadansoddom diwmorau a chelloedd T o diwmorau ac asgites cleifion â charsinoma serws gradd uchel (HGSC) i ddatgelu metabolom y gwahanol adrannau TME hyn. Mae gan asgites a chelloedd tiwmor wahaniaethau metabolyn helaeth. O'i gymharu ag asgites, mae'r celloedd T sy'n treiddio i diwmorau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn 1-methylnicotinamid (MNA). Er bod lefel MNA mewn celloedd T yn uchel, mae mynegiant nicotinamid N-methyltransferase (ensym sy'n cataleiddio trosglwyddo grwpiau methyl o S-adenosylmethionine i nicotinamid) wedi'i gyfyngu i ffibroblastau a chelloedd tiwmor. Yn swyddogaethol, mae MNA yn ysgogi celloedd T i secretu'r cytocin sy'n hyrwyddo tiwmorau, ffactor necrosis tiwmor alffa. Felly, mae MNA sy'n deillio o TME yn cyfrannu at reoleiddio imiwnedd celloedd T ac yn cynrychioli targed imiwnotherapi posibl ar gyfer trin canser dynol.
Gall metabolion sy'n deillio o diwmorau gael effaith ataliol ddofn ar imiwnedd gwrth-diwmor, ac mae mwy a mwy o dystiolaeth yn dangos y gallant hefyd wasanaethu fel grym allweddol ar gyfer datblygiad clefydau (1). Yn ogystal ag effaith Warburg, mae gwaith diweddar wedi dechrau nodweddu cyflwr metabolaidd celloedd tiwmor a'i berthynas â chyflwr imiwnedd microamgylchedd y tiwmor (TME). Mae astudiaethau ar fodelau llygoden a chelloedd T dynol wedi dangos y gall metaboledd glwtamin (2), metaboledd ocsideiddiol (3) a metaboledd glwcos (4) weithredu'n annibynnol ar wahanol is-grwpiau celloedd imiwnedd. Mae sawl metabolyn yn y llwybrau hyn yn atal swyddogaeth gwrth-diwmor celloedd T. Profwyd y gall blocâd y coensym tetrahydrobiopterin (BH4) niweidio amlhau celloedd T, a gall cynnydd BH4 yn y corff wella'r ymateb imiwnedd gwrth-diwmor a gyfryngir gan CD4 a CD8. Yn ogystal, gellir achub effaith imiwnosuppressive kynurenine trwy roi BH4 (5). Mewn glioblastoma mwtant isocitrate dehydrogenase (IDH), mae secretiad enantiometabolaidd (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) yn atal actifadu, amlhau a Gweithgaredd cytolysis celloedd T (6). Yn ddiweddar, dangoswyd bod methylglyoxal, sgil-gynnyrch glycolysis, yn cael ei gynhyrchu gan gelloedd ataliol o darddiad myeloid, a gall trosglwyddo methylglyoxal gan gelloedd T atal swyddogaeth celloedd T effeithydd. Mewn triniaeth, gall niwtraleiddio methylglyoxal oresgyn gweithgaredd celloedd ataliol sy'n deillio o myeloid (MDSC) a gwella therapi blocâd pwynt gwirio yn synergaidd mewn modelau llygod (7). Mae'r astudiaethau hyn gyda'i gilydd yn pwysleisio rôl allweddol metabolion sy'n deillio o TME wrth reoleiddio swyddogaeth a gweithgaredd celloedd T.
Mae camweithrediad celloedd T wedi cael ei adrodd yn helaeth mewn canser yr ofari (8). Mae hyn yn rhannol oherwydd y nodweddion metabolaidd sy'n gynhenid ​​​​mewn hypocsia a fasgwleiddiad tiwmor annormal (9), sy'n arwain at drosi glwcos a tryptophan yn sgil-gynhyrchion fel asid lactig a kynurenine. Mae gormod o lactad allgellog yn lleihau cynhyrchiad interferon-γ (IFN-γ) ac yn gyrru gwahaniaethu is-grwpiau myelosuppressive (10, 11). Mae bwyta tryptophan yn atal amlhau celloedd T yn uniongyrchol ac yn atal signalau derbynyddion celloedd T (12-14). Er gwaethaf yr arsylwadau hyn, cynhaliwyd llawer o waith ynghylch metaboledd imiwnedd mewn diwylliant celloedd T in vitro gan ddefnyddio cyfryngau wedi'u optimeiddio, neu wedi'i gyfyngu i fodelau llygoden homologaidd in vivo, ac nid yw'r naill na'r llall yn adlewyrchu'n llawn amrywioldeb canserau dynol a'r amgylchedd macro a micro ffisiolegol.
Nodwedd gyffredin o ganser yr ofari yw lledaeniad peritoneol ac ymddangosiad asgites. Mae cronni hylif celloedd mewn asgites yn gysylltiedig â chlefyd datblygedig a prognosis gwael (15). Yn ôl adroddiadau, mae'r adran unigryw hon yn hypocsig, mae ganddi lefelau uchel o ffactor twf endothelaidd fasgwlaidd (VEGF) ac indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ac mae celloedd rheoleiddio T a chelloedd ataliol myeloid yn treiddio iddi (15-18). Gall amgylchedd metabolaidd asgites fod yn wahanol i amgylchedd y tiwmor ei hun, felly nid yw ailraglennu celloedd T yn y gofod peritoneol yn glir. Yn ogystal, gall y gwahaniaethau allweddol a'r amrywioldeb rhwng asgites a metabolion sy'n bresennol yn amgylchedd y tiwmor rwystro treiddio celloedd imiwnedd a'u swyddogaeth ar diwmorau, ac mae angen ymchwil pellach.
Er mwyn datrys y problemau hyn, fe wnaethom gynllunio dull sbectrometreg màs tandem cromatograffaeth hylif (LC-MS/MS) sy'n gwahanu celloedd sensitif a chromatograffaeth hylif i astudio gwahanol fathau o gelloedd (gan gynnwys celloedd T CD4+ a CD8+) yn ogystal ag o fewn a rhwng tiwmorau. Mae ei fetabolion yn rhychwantu celloedd yn yr un amgylchedd asgites a thiwmor â'r claf. Rydym yn defnyddio'r dull hwn ar y cyd â cytometry llif dimensiwn uchel a dilyniannu RNA un gell (scRNA-seq) i ddarparu portread cydraniad uchel o statws metabolaidd y poblogaethau allweddol hyn. Datgelodd y dull hwn gynnydd sylweddol yn lefel 1-methylnicotinamid (MNA) mewn celloedd T tiwmor, a dangosodd arbrofion in vitro nad oedd effaith imiwno-fodiwlaidd MNA ar swyddogaeth celloedd T yn hysbys o'r blaen. Yn gyffredinol, mae'r dull hwn yn datgelu'r rhyngweithiadau metabolaidd cydfuddiannol rhwng tiwmorau a chelloedd imiwnedd, ac yn darparu mewnwelediadau unigryw i fetabolion rheoleiddio imiwnedd, a all fod yn ddefnyddiol ar gyfer trin imiwnotherapi canser yr ofari sy'n seiliedig ar gelloedd T. Cyfleoedd triniaeth.
Defnyddiwyd cytometry llif dimensiwn uchel i fesur cymeriant glwcos ar yr un pryd [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) a gweithgaredd mitocondriaidd [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) yw'r marcwyr nodweddiadol ochr yn ochr sy'n gwahaniaethu rhwng celloedd imiwnedd a phoblogaethau celloedd tiwmor (Tabl S2 a Ffigur S1A). Dangosodd y dadansoddiad hwn, o'i gymharu â chelloedd T, fod gan asgites a chelloedd tiwmor lefelau cymeriant glwcos uwch, ond bod ganddynt wahaniaethau llai mewn gweithgaredd mitocondriaidd. Mae cymeriant glwcos cyfartalog celloedd tiwmor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] dair i bedair gwaith yn fwy na chelloedd T, ac mae cymeriant glwcos cyfartalog celloedd T CD4+ 1.2 gwaith yn fwy na chelloedd T CD8+, sy'n dangos bod gan lymffocytau sy'n treiddio i diwmorau (TIL) ofynion metabolaidd gwahanol hyd yn oed yn yr un TME (Ffigur 1A). Mewn cyferbyniad, mae gweithgaredd mitocondriaidd mewn celloedd tiwmor yn debyg i weithgaredd celloedd T CD4 +, ac mae gweithgaredd mitocondriaidd y ddau fath o gell yn uwch na gweithgaredd celloedd T CD8 + (Ffigur 1B). Yn gyffredinol, mae'r canlyniadau hyn yn datgelu'r lefel metabolig. Mae gweithgaredd metabolig celloedd tiwmor yn uwch na gweithgaredd celloedd T CD4 +, ac mae gweithgaredd metabolig celloedd T CD4 + yn uwch na gweithgaredd celloedd T CD8 +. Er gwaethaf yr effeithiau hyn ar draws mathau o gelloedd, nid oes gwahaniaeth cyson yn statws metabolig celloedd T CD4 + a CD8 + na'u cyfrannau cymharol mewn asgites o'i gymharu â thiwmorau (Ffigur 1C). Mewn cyferbyniad, yn y ffracsiwn celloedd CD45, cynyddodd cyfran y celloedd EpCAM + yn y tiwmor o'i gymharu ag asgites (Ffigur 1D). Gwelsom hefyd wahaniaeth metabolig clir rhwng cydrannau celloedd EpCAM + ac EpCAM-. Mae gan gelloedd EpCAM + (tiwmor) gymeriant glwcos a gweithgaredd mitocondriaidd uwch na chelloedd EpCAM-, sy'n llawer uwch na gweithgaredd metabolig ffibroblastau mewn celloedd tiwmor yn TME (Ffigur 1, E ac F).
(A a B) Dwyster fflwroleuedd canolrifol (MFI) o gymeriant glwcos (2-NBDG) (A) a gweithgaredd mitocondriaidd celloedd T CD4 + (MitoTracker coch tywyll) (B) Graffiau cynrychioliadol (chwith) a data mewn tabl (Dde), celloedd T CD8 + a chelloedd tiwmor EpCAM + CD45 o asgites a thiwmor. (C) Cymhareb celloedd CD4 + a CD8 + (o gelloedd T CD3 +) mewn asgites a thiwmor. (D) Cyfran celloedd tiwmor EpCAM + mewn asgites a thiwmor (CD45−). (E ac F) Cymeriant glwcos tiwmor EpCAM + CD45 ac EpCAM-CD45-matrics (2-NBDG) (E) a gweithgaredd mitocondriaidd (MitoTracker coch tywyll) (F) graffiau cynrychioliadol (chwith) a data mewn tabl (Dde) Asgites a chelloedd tiwmor. (G) Graffiau cynrychioliadol o fynegiant CD25, CD137 a PD1 trwy cytometry llif. (H ac I) Mynegiant CD25, CD137 a PD1 ar gelloedd T CD4 + (H) a chelloedd T CD8 + (I). (J a K) Ffenoteipiau naïf, cof canolog (Tcm), effeithydd (Teff) a chof effeithydd (Tem) yn seiliedig ar fynegiant CCR7 a CD45RO. Delweddau cynrychioliadol (chwith) a data tablaidd (dde) o gelloedd T CD4 + (J) a chelloedd T CD8 + (K) mewn asgites a thiwmorau. Gwerthoedd P wedi'u pennu gan brawf-t paru (*P<0.05, **P<0.01 a ***P<0.001). Mae'r llinell yn cynrychioli cleifion cyfatebol (n = 6). FMO, fflwroleuedd minws un; MFI, dwyster fflwroleuedd canolrifol.
Datgelodd dadansoddiad pellach wahaniaethau arwyddocaol eraill rhwng statws ffenoteip celloedd T sydd wedi'u datrys yn dda iawn. Mae'r cof wedi'i actifadu (Ffigur 1, G i I) a'r cof effeithiol (Ffigur 1, J a K) mewn tiwmorau yn llawer amlach na'r asgites (cyfran o gelloedd T CD3+). Yn yr un modd, dangosodd dadansoddi'r ffenoteip yn ôl mynegiant marcwyr actifadu (CD25 a CD137) a marcwyr disbyddu [protein marwolaeth celloedd wedi'i raglennu 1 (PD1)], er bod nodweddion metabolaidd y poblogaethau hyn yn wahanol (Ffigur S1, B i E), na welwyd unrhyw wahaniaethau metabolaidd arwyddocaol yn gyson rhwng is-setiau naïf, effeithiol neu gof (Ffigur S1, F i I). Cadarnhawyd y canlyniadau hyn trwy ddefnyddio dulliau dysgu peirianyddol i neilltuo ffenoteipiau celloedd yn awtomatig (21), a ddatgelodd ymhellach bresenoldeb nifer fawr o gelloedd mêr esgyrn (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) yn asgites y claf (Ffigur S2A). Ymhlith yr holl fathau o gelloedd a nodwyd, y boblogaeth hon o gelloedd myeloid a ddangosodd y gyfradd amsugno glwcos a'r gweithgaredd mitocondriaidd uchaf (Ffigur S2, B i G). Mae'r canlyniadau hyn yn tynnu sylw at y gwahaniaethau metabolaidd cryf rhwng y mathau lluosog o gelloedd a geir mewn asgites a thiwmorau mewn cleifion HGSC.
Y brif her wrth ddeall nodweddion metabolonomig TIL yw'r angen i ynysu samplau celloedd T o burdeb, ansawdd a maint digonol o diwmorau. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos y gall dulliau didoli a chyfoethogi gleiniau yn seiliedig ar cytometry llif arwain at newidiadau mewn proffiliau metabolion cellog (22-24). I oresgyn y broblem hon, fe wnaethom optimeiddio'r dull cyfoethogi gleiniau i ynysu ac ynysu TIL o ganser ofarïaidd dynol a gafodd ei dorri'n llawfeddygol cyn ei ddadansoddi gan LC-MS/MS (gweler Deunyddiau a Dulliau; Ffigur 2A). Er mwyn asesu effaith gyffredinol y protocol hwn ar newidiadau metabolion, fe wnaethom gymharu proffiliau metabolion celloedd T a actifadwyd gan roddwyr iach ar ôl y cam gwahanu gleiniau uchod â chelloedd nad oeddent wedi'u gwahanu â gleiniau ond a arhosodd ar rew. Canfu'r dadansoddiad rheoli ansawdd hwn fod cydberthynas uchel rhwng y ddau gyflwr hyn (r = 0.77), ac mae gan ailadroddadwyedd technegol y grŵp o 86 metabolyn ailadroddadwyedd uchel (Ffigur 2B). Felly, gall y dulliau hyn gynnal dadansoddiad metabolyn cywir mewn celloedd sy'n cael eu cyfoethogi o ran mathau o gelloedd, gan ddarparu'r platfform cydraniad uchel cyntaf ar gyfer nodi metabolynau penodol yn HGSC, a thrwy hynny alluogi pobl i gael dealltwriaeth ddyfnach o benodolrwydd celloedd.
(A) Diagram sgematig o gyfoethogi gleiniau magnetig. Cyn dadansoddi gan LC-MS/MS, bydd y celloedd yn cael tair rownd olynol o gyfoethogi gleiniau magnetig neu'n aros ar rew. (B) Effaith y math o gyfoethogi ar helaethrwydd metabolion. Cyfartaledd tair mesuriad ar gyfer pob math o gyfoethogi ± SE. Mae'r llinell lwyd yn cynrychioli perthynas 1:1. Y gydberthynas fewn-ddosbarth (ICC) o fesuriadau ailadroddus a ddangosir yn label yr echelin. NAD, nicotinamid adenine dinucleotide. (C) Diagram sgematig o lif gwaith dadansoddi metabolion cleifion. Cesglir asgites neu diwmorau gan gleifion a'u rhewi-gadw. Dadansoddwyd cyfran fach o bob sampl gan cytometry llif, tra bod y samplau sy'n weddill wedi cael tair rownd o gyfoethogi ar gyfer celloedd CD4+, CD8+ a CD45-. Dadansoddwyd y ffracsiynau celloedd hyn gan ddefnyddio LC-MS/MS. (D) Map gwres o helaethrwydd metabolyn safonol. Mae'r dendrogram yn cynrychioli clystyru Ward o bellteroedd Ewclidaidd rhwng samplau. (E) Dadansoddiad prif gydrannau (PCA) o fap metabolyn sampl, gan ddangos tri dyblygiad o bob sampl, mae samplau o'r un claf wedi'u cysylltu gan linell. (F) PCA proffil metabolyn y sampl wedi'i gyflyru ar y claf (h.y., gan ddefnyddio diswyddiad rhannol); mae'r math o sampl wedi'i gyfyngu gan y plisgyn amgrwm. PC1, prif gydran 1; PC2, prif gydran 2.
Nesaf, fe wnaethom gymhwyso'r dull cyfoethogi hwn i ddadansoddi 99 o fetabolion yn y ffracsiynau celloedd CD4 +, CD8 + a CD45 yn asgites a thiwmorau cynradd chwech o gleifion HGSC (Ffigur 2C, Ffigur S3A a Thabl S3 ac S4). Mae'r boblogaeth o ddiddordeb yn cyfrif am 2% i 70% o'r sampl fawr wreiddiol o gelloedd byw, ac mae cyfran y celloedd yn amrywio'n fawr rhwng cleifion. Ar ôl gwahanu'r gleiniau, mae'r ffracsiwn cyfoethog o ddiddordeb (CD4 +, CD8 + neu CD45-) yn cyfrif am fwy nag 85% o'r holl gelloedd byw yn y sampl ar gyfartaledd. Mae'r dull cyfoethogi hwn yn caniatáu inni ddadansoddi poblogaethau celloedd o fetaboledd meinwe tiwmor dynol, sy'n amhosibl ei wneud o samplau mawr. Gan ddefnyddio'r protocol hwn, fe benderfynon ni fod l-kynurenine ac adenosine, y ddau fetabol imiwnosuppressive nodweddedig hyn, wedi'u codi mewn celloedd T tiwmor neu gelloedd tiwmor (Ffigur S3, B a C). Felly, mae'r canlyniadau hyn yn dangos ffyddlondeb a gallu ein technoleg gwahanu celloedd a sbectrometreg màs i ddod o hyd i fetabolion pwysig yn fiolegol mewn meinweoedd cleifion.
Datgelodd ein dadansoddiad hefyd wahaniad metabolaidd cryf o fathau o gelloedd o fewn a rhwng cleifion (Ffigur 2D a Ffigur S4A). Yn benodol, o'i gymharu â chleifion eraill, dangosodd claf 70 nodweddion metabolaidd gwahanol (Ffigur 2E a Ffigur S4B), gan ddangos y gallai fod amrywioldeb metabolaidd sylweddol rhwng cleifion. Mae'n werth nodi, o'i gymharu â chleifion eraill (1.2 i 2 litr; Tabl S1), fod cyfanswm yr asgites a gasglwyd yng nghlaf 70 (80 ml) yn llai. Mae'r rheolaeth ar amrywioldeb rhyng-gleifion yn ystod dadansoddiad prif gydrannau (er enghraifft, gan ddefnyddio dadansoddiad diswyddiad rhannol) yn dangos newidiadau cyson rhwng mathau o gelloedd, ac mae'r mathau o gelloedd a/neu'r microamgylchedd wedi'u crynhoi'n glir yn ôl proffil y metabolyn (Ffigur 2F). Pwysleisiodd y dadansoddiad o fetabolion sengl yr effeithiau hyn a datgelodd wahaniaethau sylweddol rhwng mathau o gelloedd a microamgylchedd. Mae'n werth nodi mai'r gwahaniaeth mwyaf eithafol a welwyd yw MNA, sydd fel arfer wedi'i gyfoethogi mewn celloedd CD45- ac mewn celloedd CD4+ a CD8+ sy'n treiddio i'r tiwmor (Ffigur 3A). Ar gyfer celloedd CD4+, mae'r effaith hon yn fwyaf amlwg, ac mae'n ymddangos bod yr amgylchedd hefyd yn effeithio'n gryf ar yr MNA mewn celloedd CD8+. Fodd bynnag, nid yw hyn yn bwysig, oherwydd dim ond tri o'r chwe chlaf y gellir eu gwerthuso ar gyfer sgoriau CD8+ tiwmor. Yn ogystal ag MNA, mewn gwahanol fathau o gelloedd mewn asgites a thiwmorau, mae metabolion eraill sydd wedi'u nodweddu'n wael mewn TIL hefyd yn gyfoethog yn wahanol (Ffigurau S3 ac S4). Felly, mae'r data hyn yn datgelu set addawol o fetabolion imiwno-fodiwlaidd ar gyfer ymchwil bellach.
(A) Cynnwys MNA wedi'i normaleiddio mewn celloedd CD4+, CD8+ a CD45- o asgites a thiwmor. Mae'r plot bocs yn dangos y canolrif (llinell), yr ystod rhyngchwartel (colyn ffrâm) a'r ystod ddata, hyd at 1.5 gwaith yr ystod rhyngchwartel (mwsg ffrâm). Fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau Cleifion, defnyddiwch werth limma'r claf i bennu'r gwerth P (*P<0.05 a **P<0.01). (B) Diagram sgematig o fetaboledd MNA (60). Metabolitau: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamid; MNA, 1-methylnicotinamid; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamid; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamid; NR, ribose nicotinamid; NMN, mononiwcleotid nicotinamid. Ensymau (gwyrdd): NNMT, nicotinamid N-methyltransferase; SIRT, sirtuinau; NAMPT, nicotinamid ffosfforibosyl transferase; AOX1, aldehyd ocsidase 1; NRK, nicotinamid ribosid kinase; NMNAT, nicotinamid mono Niwcleotid adenylate transferase; Pnp1, purine niwcleoside ffosfforylase. (C) t-SNE o scRNA-seq o asgites (llwyd) a thiwmor (coch; n = 3 chlaf). (D) Mynegiant NNMT mewn gwahanol boblogaethau celloedd a nodwyd gan ddefnyddio scRNA-seq. (E) Mynegiant NNMT ac AOX1 mewn celloedd T SK-OV-3, aren embryonig ddynol (HEK) 293T, a chelloedd T wedi'u trin ag MNA. Dangosir y mynegiant plygedig o'i gymharu â SK-OV-3. Dangosir y patrwm mynegiant gyda SEM (n = 6 rhoddwr iach). Ystyrir bod gwerthoedd Ct sy'n fwy na 35 yn anghanfyddadwy (UD). (F) Mynegiant SLC22A1 a SLC22A2 mewn celloedd T SK-OV-3, HEK293T, a chelloedd T wedi'u trin ag 8mM o MNA. Dangosir y mynegiant plygedig o'i gymharu â SK-OV-3. Dangosir y patrwm mynegiant gyda SEM (n = 6 rhoddwr iach). Ystyrir bod gwerthoedd Ct sy'n fwy na 35 yn anghanfyddadwy (UD). (G) Cynnwys celloedd MNA mewn celloedd T rhoddwr iach wedi'u actifadu ar ôl 72 awr o ddeori gydag MNA. Dangosir y patrwm mynegiant gyda SEM (n = 4 rhoddwr iach).
Cynhyrchir MNA trwy drosglwyddo'r grŵp methyl o S-adenosyl-1-methionine (SAM) i nicotinamid (NA) gan nicotinamid N-methyltransferase (NNMT; Ffigur 3B). Mae NNMT yn cael ei or-fynegi mewn amrywiaeth o ganserau dynol ac mae'n gysylltiedig ag amlhau, goresgyniad a metastasis (25-27). Er mwyn deall ffynhonnell MNA mewn celloedd T mewn TME yn well, fe wnaethom ddefnyddio scRNA-seq i nodweddu mynegiant NNMT ar draws mathau o gelloedd yn asgites a thiwmorau tri chlaf HGSC (Tabl S5). Dangosodd dadansoddiad o tua 6,500 o gelloedd, mewn amgylcheddau asgites a thiwmor, fod mynegiant NNMT wedi'i gyfyngu i'r poblogaethau celloedd ffibroblast a thiwmor tybiedig (Ffigur 3, C a D). Mae'n werth nodi nad oes mynegiant NNMT amlwg mewn unrhyw boblogaeth sy'n mynegi PTPRC (CD45 +) (Ffigur 3D a Ffigur S5A), sy'n dangos bod yr MNA a ganfuwyd yn y sbectrwm metabolyn wedi'i gyflwyno i gelloedd T. Mae mynegiant aldehyd ocsidase 1 (AOX1) yn trosi MNA yn 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamid (2-PYR) neu 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamid (4-PYR); mae Ffigur 3B) hefyd wedi'i gyfyngu i'r boblogaeth o ffibroblastau sy'n mynegi COL1A1 (Ffigur S5A), sydd gyda'i gilydd yn dangos nad oes gan gelloedd T y gallu i fetaboli MNA confensiynol. Gwiriwyd patrwm mynegiant y genynnau hyn sy'n gysylltiedig ag MNA gan ddefnyddio ail set ddata celloedd annibynnol o asgites gan gleifion HGSC (Ffigur S5B; n = 6) (16). Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad adwaith cadwyn polymerase meintiol (qPCR) o gelloedd T rhoddwr iach a gafodd eu trin ag MNA, o'i gymharu â chelloedd tiwmor ofarïaidd rheoli SK-OV-3, nad oedd NNMT na AOX1 bron wedi'i fynegi (Ffigur 3E). Mae'r canlyniadau annisgwyl hyn yn dangos y gallai MNA gael ei ysgarthu o ffibroblastau neu diwmorau i gelloedd T cyfagos yn TME.
Er bod yr ymgeiswyr yn cynnwys y teulu o gludwyr cation organig 1 i 3 (OCT1, OCT2 ac OCT3) a amgodir gan y teulu cludwr hydawdd 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ac SLC22A3), mae cludwyr posibl MNA yn dal heb eu diffinio (28). Dangosodd QPCR mRNA o gelloedd T rhoddwr iach lefelau mynegiant isel o SLC22A1 ond lefelau na ellir eu canfod o SLC22A2, a gadarnhaodd ei fod wedi'i adrodd yn flaenorol yn y llenyddiaeth (Ffigur 3F) (29). Mewn cyferbyniad, mynegodd llinell gelloedd tiwmor ofarïaidd SK-OV-3 lefelau uchel o'r ddau gludwr (Ffigur 3F).
Er mwyn profi'r posibilrwydd bod gan gelloedd T y gallu i amsugno MNA tramor, cafodd celloedd T rhoddwr iach eu meithrin am 72 awr ym mhresenoldeb gwahanol grynodiadau o MNA. Yn absenoldeb MNA alldarddol, ni ellir canfod cynnwys cellog MNA (Ffigur 3G). Fodd bynnag, dangosodd celloedd T wedi'u actifadu a gafodd eu trin ag MNA alldarddol gynnydd sy'n ddibynnol ar ddos ​​​​yng nghynnwys MNA yn y celloedd, hyd at 6 mM MNA (Ffigur 3G). Mae'r canlyniad hwn yn dangos, er gwaethaf y lefel isel o fynegiant cludwr a diffyg y prif ensym sy'n gyfrifol am fetaboledd MNA mewngellol, y gall TIL ddal i amsugno MNA.
Mae sbectrwm y metabolion mewn celloedd T cleifion ac arbrofion amsugno MNA in vitro yn cynyddu'r posibilrwydd bod ffibroblastau sy'n gysylltiedig â chanser (CAF) yn secretu MNA a bod celloedd tiwmor yn gallu rheoleiddio ffenoteip a swyddogaeth TIL. I bennu effaith MNA ar gelloedd T, actifadu celloedd T rhoddwr iach in vitro ym mhresenoldeb neu absenoldeb MNA, a gwerthuswyd eu lluosogiad a'u cynhyrchiad cytocin. Ar ôl 7 diwrnod o ychwanegu MNA ar y dos uchaf, gostyngwyd nifer y boblogaeth yn gymedrol, tra cynhaliwyd egni ym mhob dos (Ffigur 4A). Yn ogystal, arweiniodd triniaeth MNA alldarddol at gynnydd yng nghyfran y celloedd T CD4 + a CD8 + a oedd yn mynegi ffactor necrosis tiwmor-α (TNFα; Ffigur 4B). Mewn cyferbyniad, gostyngwyd cynhyrchiad mewngellol IFN-γ yn sylweddol mewn celloedd T CD4 +, ond nid mewn celloedd T CD8 +, ac nid oedd unrhyw newid sylweddol yn interleukin 2 (IL-2; Ffigur 4, C a D). Felly, dangosodd assay imiwno-amsugnol cysylltiedig ag ensymau (ELISA) o uwchnofiadau o'r diwylliannau celloedd T hyn a gafodd eu trin ag MNA gynnydd sylweddol yn TNFα, gostyngiad yn IFN-γ, a dim newid yn IL-2 (Ffigur 4, E i G). . Mae'r gostyngiad mewn IFN-γ yn dangos y gallai MNA chwarae rhan wrth atal gweithgaredd gwrth-diwmor celloedd T. Er mwyn efelychu effaith MNA ar wenwyndra celloedd T, cynhyrchir celloedd derbynnydd antigen chimerig T (FRα-CAR-T) sy'n targedu derbynnydd ffolad α a chelloedd CAR-T (GFP) a reoleiddir gan brotein fflwroleuol gwyrdd (GFP) -CAR-T) gan gelloedd mononiwclear gwaed ymylol rhoddwr iach (PBMC). Cafodd celloedd CAR-T eu meithrin am 24 awr ym mhresenoldeb MNA, ac yna eu cyd-ddiwyllio â chelloedd tiwmor ofarïaidd SK-OV-3 dynol sy'n mynegi derbynnydd ffolad α ar gymhareb effeithydd i darged o 10:1. Arweiniodd triniaeth MNA at ostyngiad sylweddol yng ngweithgaredd lladd celloedd FRα-CAR-T, a oedd yn debyg i gelloedd FRα-CAR-T a gafodd eu trin ag adenosin (Ffigur 4H).
(A) Cyfanswm cyfrif celloedd hyfyw a dyblu poblogaeth (PD) yn uniongyrchol o ddiwylliant ar ddiwrnod 7. Mae'r graff bar yn cynrychioli'r cymedr + SEM chwe rhoddwr iach. Yn cynrychioli data o o leiaf n = 3 arbrawf annibynnol. (B i D) Defnyddiwyd CD3/CD28 ac IL-2 i actifadu celloedd T yn eu crynodiadau MNA priodol am 7 diwrnod. Cyn dadansoddi, cafodd celloedd eu symbylu â PMA/ionomycin gyda GolgiStop am 4 awr. Mynegiant TNFα (B) mewn celloedd T. Delwedd enghreifftiol (chwith) a data tablaidd (dde) o fynegiant TNFα mewn celloedd byw. Mynegiant IFN-γ (C) ac IL-2 (D) mewn celloedd T. Mesurwyd mynegiant cytocinau gan cytometry llif. Mae'r graff bar yn cynrychioli'r cymedr (n = 6 rhoddwr iach) + SEM. Defnyddiwch ddadansoddiad amrywiant unffordd a mesurau ailadroddus (*P<0.05 a **P<0.01) i bennu'r gwerth P. Yn cynrychioli data o o leiaf n = 3 arbrawf annibynnol. (E i G) Defnyddiwyd CD3/CD28 ac IL-2 i actifadu celloedd T yn eu crynodiadau MNA priodol am 7 diwrnod. Casglwyd y cyfrwng cyn ac ar ôl 4 awr o ysgogiad PMA/ionomycin. Mesurwyd crynodiadau TNFα (E), IFN-γ (F) ac IL-2 (G) gan ddefnyddio ELISA. Mae'r graff bar yn cynrychioli'r cymedr (n = 5 rhoddwr iach) + SEM. Gwerth P wedi'i bennu gan ddefnyddio dadansoddiad amrywiant unffordd a mesuriadau ailadroddus (*P<0.05). Mae'r llinell ddotiog yn nodi terfyn canfod y canfod. (H) Asesiad lysis celloedd. Addaswyd celloedd FRα-CAR-T neu GFP-CAR-T gydag adenosine (250μM) neu MNA (10 mM) am 24 awr, neu eu gadael heb eu trin (Ctrl). Mesurwyd canran lladd celloedd SK-OV-3. Gwerth P wedi'i bennu gan brawf t Welch (*P<0.5 a **P<0.01).
Er mwyn cael dealltwriaeth fecanistig o reoleiddio mynegiant TNFα sy'n ddibynnol ar MNA, gwerthuswyd y newidiadau yn mRNA TNFα celloedd T a gafodd eu trin ag MNA (Ffigur 5A). Dangosodd celloedd T rhoddwr iach a gafodd eu trin ag MNA gynnydd deublyg mewn lefelau trawsgrifio TNFα, sy'n dangos bod MNA yn ddibynnol ar reoleiddio trawsgrifio TNFα. I ymchwilio i'r mecanwaith rheoleiddio posibl hwn, gwerthuswyd dau ffactor trawsgrifio hysbys sy'n rheoleiddio TNFα, sef ffactor niwclear celloedd T wedi'u actifadu (NFAT) a phrotein penodol 1 (Sp1), mewn ymateb i rwymo MNA i'r hyrwyddwr TNFα proximal (30). Mae'r hyrwyddwr TNFα yn cynnwys 6 safle rhwymo NFAT a nodwyd a 2 safle rhwymo Sp1, sy'n gorgyffwrdd mewn un safle [-55 pâr sylfaen (bp) o'r 5'cap] (30). Dangosodd imiwno-ddyfodiad cromatin (ChIP), pan gafodd ei drin ag MNA, fod rhwymo Sp1 i'r hyrwyddwr TNFα wedi cynyddu dair gwaith. Cynyddodd ymgorffori NFAT hefyd a daeth yn bwysicach (Ffigur 5B). Mae'r data hyn yn dangos bod MNA yn rheoleiddio mynegiant TNFα trwy drawsgrifiad Sp1, ac i raddau llai mynegiant NFAT.
(A) O'i gymharu â chelloedd T a gafodd eu meithrin heb MNA, y newid plyg mewn mynegiant TNFα mewn celloedd T a gafodd eu trin ag MNA. Dangosir y patrwm mynegiant gyda SEM (n = 5 rhoddwr iach). Yn cynrychioli data o o leiaf n = 3 arbrawf annibynnol. (B) Hyrwyddwr TNFα celloedd T a gafodd eu trin â neu heb 8 mM MNA ar ôl i NFAT a Sp1 gael eu cyfuno ag ysgogiad (Ctrl) ac PMA/ionomycin am 4 awr. Defnyddiwyd imiwnoglobwlin G (IgG) a H3 fel rheolyddion negatif a chadarnhaol ar gyfer imiwno-ddyfnder, yn y drefn honno. Dangosodd meintioli ChIP fod rhwymo Sp1 ac NFAT i'r hyrwyddwr TNFα mewn celloedd a gafodd eu trin ag MNA wedi cynyddu sawl gwaith o'i gymharu â'r rheolydd. Yn cynrychioli data o o leiaf n = 3 arbrawf annibynnol. Gwerth P wedi'i bennu gan brofion-t lluosog (*** P <0.01). (C) O'i gymharu ag asgites HGSC, dangosodd celloedd T (heb fod yn cytotocsig) fynegiant cynyddol o TNF yn y tiwmor. Mae'r lliwiau'n cynrychioli gwahanol gleifion. Mae'r celloedd a ddangosir wedi'u samplu ar hap i 300 a'u crynu i gyfyngu ar or-ddarlunio (** Padj = 0.0076). (D) Model arfaethedig o MNA ar gyfer canser yr ofari. Cynhyrchir MNA mewn celloedd tiwmor a ffibroblastau yn TME ac mae'n cael ei gymryd i fyny gan gelloedd T. Mae MNA yn cynyddu rhwymo Sp1 i'r hyrwyddwr TNFα, gan arwain at gynnydd mewn trawsgrifio TNFα a chynhyrchu cytocin TNFα. Mae MNA hefyd yn achosi gostyngiad yn IFN-γ. Mae atal swyddogaeth celloedd T yn arwain at ostyngiad yn y gallu i ladd a chyflymu twf tiwmor.
Yn ôl adroddiadau, mae gan TNFα effeithiau gwrth-diwmor a gwrth-diwmor sy'n ddibynnol ar y blaen a'r cefn, ond mae ganddo rôl adnabyddus wrth hyrwyddo twf a metastasis canser yr ofari (31-33). Yn ôl adroddiadau, mae crynodiad TNFα mewn asgites a meinweoedd tiwmor mewn cleifion â chanser yr ofari yn uwch nag mewn meinweoedd diniwed (34-36). O ran mecanwaith, gall TNFα reoleiddio actifadu, swyddogaeth ac amlhau celloedd gwaed gwyn, a newid ffenoteip celloedd canser (37, 38). Yn gyson â'r canfyddiadau hyn, dangosodd dadansoddiad mynegiant genynnau gwahaniaethol fod TNF wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol mewn celloedd T mewn meinweoedd tiwmor o'i gymharu ag asgites (Ffigur 5C). Dim ond mewn poblogaethau celloedd T â ffenoteip nad yw'n cytotocsig yr oedd y cynnydd mewn mynegiant TNF yn amlwg (Ffigur S5A). I ​​grynhoi, mae'r data hyn yn cefnogi'r farn bod gan MNA effeithiau imiwnosuppressive a hyrwyddo tiwmor deuol mewn HGSC.
Mae labelu fflwroleuol yn seiliedig ar cytometry llif wedi dod yn brif ddull ar gyfer astudio metaboledd TIL. Mae'r astudiaethau hyn wedi dangos, o'i gymharu â lymffocytau gwaed ymylol neu gelloedd T o organau lymffoid eilaidd, bod gan TIL murine a dynol duedd uwch i amsugno glwcos (4, 39) a cholli swyddogaeth mitocondriaidd yn raddol (19, 40). Er ein bod wedi gweld canlyniadau tebyg yn yr astudiaeth hon, y datblygiad allweddol yw cymharu metaboledd celloedd tiwmor a TIL o'r un meinwe tiwmor a dynnwyd. Yn gyson â rhai o'r adroddiadau blaenorol hyn, mae gan gelloedd tiwmor (CD45-EpCAM +) o asgites a thiwmorau amsugno glwcos uwch na chelloedd T CD8 + a CD4 +, gan gefnogi y gellir cymharu'r amsugno glwcos uchel o gelloedd tiwmor â chelloedd T. Y cysyniad o gystadleuaeth celloedd T. TME. Fodd bynnag, mae gweithgaredd mitocondriaidd celloedd tiwmor yn uwch na gweithgaredd celloedd T CD8 +, ond mae'r gweithgaredd mitocondriaidd yn debyg i weithgaredd celloedd T CD4 +. Mae'r canlyniadau hyn yn atgyfnerthu'r thema sy'n dod i'r amlwg bod metaboledd ocsideiddiol yn bwysig ar gyfer celloedd tiwmor (41, 42). Maent hefyd yn awgrymu y gallai celloedd T CD8+ fod yn fwy agored i gamweithrediad ocsideiddiol na chelloedd T CD4+, neu y gallai celloedd T CD4+ ddefnyddio ffynonellau carbon heblaw glwcos i gynnal gweithgaredd mitocondriaidd (43, 44). Dylid nodi na welsom unrhyw wahaniaeth mewn cymeriant glwcos na gweithgaredd mitocondriaidd rhwng effeithyddion T CD4+, cof effeithyddion T a chelloedd cof canolog T mewn asgites. Yn yr un modd, nid oes gan gyflwr gwahaniaethu celloedd T CD8+ mewn tiwmorau ddim i'w wneud â newidiadau mewn cymeriant glwcos, gan amlygu'r gwahaniaeth sylweddol rhwng celloedd T a feithrinwyd in vitro a TIL dynol in vivo (22). Cadarnhawyd yr arsylwadau hyn hefyd trwy ddefnyddio dyraniad poblogaeth celloedd awtomatig diduedd, a ddatgelodd ymhellach fod celloedd CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ gyda chymeriant glwcos a gweithgaredd mitocondriaidd uwch na chelloedd tiwmor yn gyffredin ond bod ganddynt boblogaeth o gelloedd metabolaidd gweithredol. Gall y boblogaeth hon gynrychioli'r is-boblogaeth tybiedig o gelloedd atalydd myeloid neu gelloedd dendritig plasmacytoid a nodwyd yn y dadansoddiad scRNA-seq. Er bod y ddau hyn wedi cael eu hadrodd mewn tiwmorau ofarïaidd dynol [45], mae angen gwaith pellach arnynt o hyd, sef disgrifio'r is-boblogaeth myeloid hon.
Er y gall dulliau sy'n seiliedig ar cytometry llif egluro'r gwahaniaethau cyffredinol mewn glwcos a metaboledd ocsideiddiol rhwng mathau o gelloedd, nid yw'r metabolion manwl gywir a gynhyrchir gan glwcos neu ffynonellau carbon eraill ar gyfer metaboledd mitocondriaidd yn TME wedi'u pennu eto. Mae neilltuo presenoldeb neu absenoldeb metabolion i is-set TIL penodol yn gofyn am buro'r boblogaeth gelloedd o'r meinwe wedi'i thorri allan. Felly, gall ein dull cyfoethogi celloedd ynghyd â sbectrometreg màs roi cipolwg ar y metabolion sy'n cael eu cyfoethogi'n wahanol mewn celloedd T a phoblogaethau celloedd tiwmor mewn samplau cleifion cyfatebol. Er bod gan y dull hwn fanteision dros ddidoli celloedd wedi'u actifadu gan fflwroleuedd, gall llyfrgelloedd metabolion penodol gael eu heffeithio oherwydd sefydlogrwydd cynhenid ​​a/neu gyfradd trosiant cyflym (22). Serch hynny, roedd ein dull yn gallu nodi dau fetabolit imiwnosuppressive cydnabyddedig, adenosine a kynurenine, oherwydd eu bod yn amrywio'n fawr rhwng mathau o samplau.
Mae ein dadansoddiad metabonomig o diwmorau ac isdeipiau TIL yn rhoi mwy o fewnwelediad i rôl metabolion mewn TME ofarïaidd. Yn gyntaf, gan ddefnyddio cytometry llif, fe benderfynon ni nad oedd gwahaniaeth yng ngweithgaredd mitocondriaidd rhwng tiwmorau a chelloedd T CD4 +. Fodd bynnag, datgelodd dadansoddiad LC-MS/MS newidiadau sylweddol yn nifer y metabolion ymhlith y poblogaethau hyn, gan ddangos bod angen dehongli casgliadau am fetaboledd TIL a'i weithgaredd metabolaidd cyffredinol yn ofalus. Yn ail, MNA yw'r metabolyn gyda'r gwahaniaeth mwyaf rhwng celloedd CD45 a chelloedd T mewn asgites, nid tiwmorau. Felly, gall adrannu a lleoliad tiwmor gael effeithiau gwahanol ar fetaboledd TIL, sy'n tynnu sylw at yr amrywioldeb posibl mewn microamgylchedd penodol. Yn drydydd, mae mynegiant yr ensym NNMT sy'n cynhyrchu MNA wedi'i gyfyngu'n bennaf i CAF, sef celloedd tiwmor i raddau llai, ond gwelir lefelau MNA canfyddadwy mewn celloedd T sy'n deillio o diwmor. Mae gan orfynegiant NNMT mewn CAF ofarïaidd effaith hyrwyddo canser hysbys, yn rhannol oherwydd hyrwyddo metaboledd CAF, goresgyniad tiwmor a metastasis (27). Er bod lefel gyffredinol TIL yn gymedrol, mae mynegiant NNMT mewn CAF yn gysylltiedig yn agos ag isdeip mesenchymal Atlas Genom Canser (TCGA), sy'n gysylltiedig â prognosis gwael (27, 46, 47). Yn olaf, mae mynegiant yr ensym AOX1 sy'n gyfrifol am ddiraddio MNA hefyd yn gyfyngedig i'r boblogaeth CAF, sy'n dangos nad oes gan gelloedd T y gallu i fetaboli MNA. Mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi'r syniad, er bod angen gwaith pellach i wirio'r canfyddiad hwn, y gallai lefelau uchel o MNA mewn celloedd T ddangos presenoldeb microamgylchedd CAF sy'n atal imiwnedd.
O ystyried lefel mynegiant isel cludwyr MNA a'r lefelau anghanfyddadwy o broteinau allweddol sy'n ymwneud â metaboledd MNA, mae presenoldeb MNA mewn celloedd T yn annisgwyl. Ni ellid canfod NNMT na AOX1 trwy ddadansoddiad scRNA-seq a qPCR wedi'i dargedu o ddau garfan annibynnol. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos nad yw MNA yn cael ei syntheseiddio gan gelloedd T, ond ei fod yn cael ei amsugno o TME cyfagos. Mae arbrofion in vitro yn dangos bod celloedd T yn tueddu i gronni MNA alldarddol.
Mae ein hastudiaethau in vitro wedi dangos bod MNA alldarddol yn ysgogi mynegiant TNFα mewn celloedd T ac yn gwella rhwymiad Sp1 i hyrwyddwr TNFα. Er bod gan TNFα swyddogaethau gwrth-diwmor a gwrth-diwmor, mewn canser yr ofari, gall TNFα hyrwyddo twf canser yr ofari (31-33). Gall niwtraleiddio TNFα mewn diwylliant celloedd tiwmor yr ofari neu ddileu signal TNFα mewn modelau llygoden wella cynhyrchiad cytocin llidiol a gyfryngir gan TNFα ac atal twf tiwmor (32, 35). Felly, yn yr achos hwn, gall MNA sy'n deillio o TME weithredu fel metabolyn pro-llidiol trwy fecanwaith sy'n ddibynnol ar TNFα trwy'r ddolen awtocrin, a thrwy hynny hyrwyddo digwyddiad a lledaeniad canser yr ofari (31). Yn seiliedig ar y posibilrwydd hwn, mae blocâd TNFα yn cael ei astudio fel asiant therapiwtig posibl ar gyfer canser yr ofari (37, 48, 49). Yn ogystal, mae MNA yn amharu ar wenwyndra celloedd CAR-T i gelloedd tiwmor yr ofari, gan ddarparu tystiolaeth bellach ar gyfer atal imiwnedd a gyfryngir gan MNA. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu model lle mae tiwmorau a chelloedd CAF yn secretu MNA i TME allgellog. Trwy (i) ysgogiad twf canser yr ofari a achosir gan TNF a (ii) ataliad gweithgaredd cytotocsig celloedd T a achosir gan MNA, gall hyn gael effaith ddwbl ar y tiwmor (Ffigur 5D).
I gloi, drwy gymhwyso cyfuniad o gyfoethogi celloedd cyflym, dilyniannu celloedd sengl a phroffilio metabolig, datgelodd yr astudiaeth hon y gwahaniaethau imiwnometabolomig enfawr rhwng tiwmorau a chelloedd asgites mewn cleifion HGSC. Dangosodd y dadansoddiad cynhwysfawr hwn fod gwahaniaethau mewn cymeriant glwcos a gweithgaredd mitocondriaidd rhwng celloedd T, a nododd MNA fel metabolyn rheoleiddio imiwnedd ymreolaethol nad yw'n rhan o gelloedd. Mae'r data hyn yn cael effaith ar sut mae TME yn effeithio ar fetaboledd celloedd T mewn canserau dynol. Er bod y gystadleuaeth uniongyrchol am faetholion rhwng celloedd T a chelloedd canser wedi'i hadrodd, gall metabolion hefyd weithredu fel rheoleiddwyr anuniongyrchol i hyrwyddo dilyniant tiwmor ac o bosibl atal ymatebion imiwnedd mewndarddol. Gall y disgrifiad pellach o rôl swyddogaethol y metabolion rheoleiddiol hyn agor strategaethau amgen ar gyfer gwella'r ymateb imiwnedd gwrth-tiwmor.
Cafwyd sbesimenau cleifion a data clinigol drwy ystorfa meinwe tiwmor canser BC sydd wedi'i hardystio gan Rwydwaith Ystorfeydd Meinweoedd Canada. Yn ôl y protocol a gymeradwywyd gan Bwyllgor Moeseg Ymchwil Canser BC a Phrifysgol British Columbia (H07-00463), cafodd pob sbesimen a data clinigol cleifion ganiatâd ysgrifenedig gwybodus neu ildiodd eu caniatâd yn ffurfiol. Mae'r samplau wedi'u storio yn y BioBank ardystiedig (BRC-00290). Dangosir nodweddion manwl cleifion yn Nhablau S1 ac S5. Ar gyfer cryopreservation, defnyddir scalpel i ddadelfennu sampl tiwmor y claf yn fecanyddol ac yna ei wthio drwy hidlydd 100-micron i gael ataliad cell sengl. Cafodd asgites y claf ei allgyrchu ar 1500 rpm am 10 munud ar 4°C i belenni'r celloedd a chael gwared ar yr uwchnofiant. Cafodd celloedd a gafwyd o diwmor ac asgites eu rhewi mewn 50% o serwm AB dynol wedi'i ddadactifadu â gwres (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) a 10% dimethyl sylffocsid. Cafodd yr ataliadau celloedd sengl hyn eu dadmer a'u defnyddio ar gyfer pennu metaboledd a metaboledd a ddisgrifir isod.
Mae'r cyfrwng cyflawn yn cynnwys 0.22 μm wedi'i hidlo 50:50 wedi'i ategu â RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glwtamin (Thermo Fisher Scientific) wedi'i ategu â 10% serwm dynol AB wedi'i ddadactifadu â gwres (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glwtamin (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x toddiant Penisilin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) a 50 μMB-mercaptoethanol. Mae AimV (Invitrogen) wedi'i ategu â 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) a 2 mM l-glwtamin (Thermo Fisher Scientific). Roedd byffer staenio'r cytometr llif yn cynnwys 0.22μm o halwynog ffosffad wedi'i hidlo (PBS; Invitrogen) wedi'i ategu â 3% serwm dynol AB wedi'i ddadactifadu â gwres (Sigma). Mae'r byffer cyfoethogi celloedd wedi'i wneud o PBS wedi'i hidlo 0.22μm ac wedi'i ategu â 0.5% o serwm AB dynol wedi'i anactifadu gan wres (Sigma-Aldrich).
Mewn cyfrwng cyflawn 37°C, staeniwyd y celloedd gyda 10 nM MT DR a 100 μM 2-NBDG am 30 munud. Nesaf, staeniwyd y celloedd gyda llifyn hyfywedd eF506 ar 4°C am 15 munud. Ail-ataliwyd y celloedd yn FC Block (eBioscience) a Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), gwanhewch mewn byffer staenio cytometr llif (yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr), a deorwch am 10 munud ar dymheredd ystafell. Staeniwch y celloedd gyda set o wrthgyrff (Tabl S2) mewn byffer staenio cytometr llif ar 4°C am 20 munud. Ail-ataliwyd y celloedd mewn byffer staenio cytometr llif (Cytek Aurora; cyfluniad 3L-16V-14B-8R) cyn dadansoddi. Defnyddiwch SpectroFlo a FlowJo V10 i ddadansoddi data cyfrif celloedd, a defnyddiwch GraphPad Prism 8 i greu'r data. Cafodd dwyster fflwroleuedd canolrifol (MFI) 2-NBDG ac MT DR ei log-normaleiddio, ac yna defnyddiwyd prawf-t pâr ar gyfer dadansoddiad ystadegol i ystyried cleifion cyfatebol. Tynnwch bob poblogaeth â llai na 40 o ddigwyddiadau o'r dadansoddiad; nodwch werth MFI o 1 ar gyfer unrhyw werthoedd negyddol cyn cynnal dadansoddiad ystadegol a delweddu data.
Er mwyn ategu'r strategaeth giatio â llaw o'r panel proses uchod, fe wnaethom ddefnyddio'r anodiad llawn gan y goeden cyfyngu siâp (FAUST) (21) i aseinio celloedd yn awtomatig i'r boblogaeth ar ôl dileu celloedd marw yn FlowJo. Rydym yn rheoli'r allbwn â llaw i uno poblogaethau sy'n ymddangos fel pe baent wedi'u camddyrannu (cyfuno celloedd PD1+ â chelloedd tiwmor PD1) a phoblogaethau a gedwir. Mae pob sampl yn cynnwys cyfartaledd o fwy na 2% o gelloedd, am gyfanswm o 11 poblogaeth.
Defnyddiwyd allgyrchu dwysedd graddiant Ficoll i wahanu PBMC oddi wrth gynhyrchion gwahanu leukocytes (STEMCELL Technologies). Ynyswyd celloedd T CD8+ o PBMC gan ddefnyddio CD8 MicroBeads (Miltenyi) a'u hehangu mewn cyfrwng cyflawn gan ddefnyddio TransAct (Miltenyi) am 2 wythnos yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Caniatawyd i'r celloedd sefyll am 5 diwrnod mewn cyfrwng cyflawn yn cynnwys IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ac yna eu hail-ysgogi gyda TransAct. Ar ddiwrnod 7, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, defnyddiwyd CD45 MicroBeads dynol (Miltenyi) i gyfoethogi celloedd mewn tair rownd olynol. Rhannwyd y celloedd ar gyfer dadansoddiad cytometry llif (fel y disgrifiwyd uchod), a rhannwyd miliwn o gelloedd dair gwaith ar gyfer dadansoddiad LC-MS/MS. Proseswyd y samplau gan LC-MS/MS fel y disgrifiwyd isod. Amcangyfrifwyd gwerth y metabolyn coll gyda rhif ïon o 1,000. Mae pob sampl yn cael ei normaleiddio gan gyfanswm nifer yr ïonau (TIC), ei drawsnewid yn logarithmig a'i normaleiddio'n awtomatig yn MetaboAnalystR cyn dadansoddi.
Cafodd ataliad celloedd sengl pob claf ei ddadmer a'i hidlo trwy hidlydd 40 μm i gyfrwng cyflawn (fel y disgrifiwyd uchod). Yn ôl protocol y gwneuthurwr, defnyddiwyd tair rownd olynol o ddetholiad positif trwy wahanu gleiniau magnetig gan ddefnyddio MicroBeads (Miltenyi) i gyfoethogi'r samplau ar gyfer celloedd CD8+, CD4+ a CD45- (ar rew). Yn gryno, caiff y celloedd eu hail-atal mewn byffer cyfoethogi celloedd (fel y disgrifiwyd uchod) a'u cyfrif. Cafodd y celloedd eu magu gyda gleiniau CD8 dynol, gleiniau CD4 dynol neu gleiniau CD45 dynol (Miltenyi) ar 4°C am 15 munud, ac yna eu golchi gyda byffer cyfoethogi celloedd. Caiff y sampl ei basio trwy'r golofn LS (Miltenyi), a chaiff y ffracsiynau positif a negatif eu casglu. Er mwyn lleihau'r hyd a gwneud y mwyaf o'r cam adfer celloedd, yna defnyddir y ffracsiwn CD8 ar gyfer yr ail rownd o gyfoethogi CD4+, a defnyddir y ffracsiwn CD4 ar gyfer y cyfoethogi CD45 dilynol. Cadwch yr hydoddiant ar rew drwy gydol y broses wahanu.
I baratoi samplau ar gyfer dadansoddi metabolynau, golchwyd y celloedd unwaith gyda hydoddiant halen oerfel iâ, ac ychwanegwyd 1 ml o fethanol 80% at bob sampl, yna eu troelli a'u rhewi'n gyflym mewn nitrogen hylifol. Cafodd y samplau eu rhoi dan dri chylch rhewi-dadmer a'u centrifugio ar 14,000 rpm am 15 munud ar 4°C. Anweddir yr uwchnofiant sy'n cynnwys y metabolynau nes ei fod yn sych. Ail-ddiddymwyd y metabolynau mewn 50 μl o asid fformig 0.03%, eu troelli i gymysgu, ac yna eu centrifugio i gael gwared ar falurion.
Echdynnwch fetabolion fel y disgrifiwyd uchod. Trosglwyddwch y uwchnofiant i botel cromatograffaeth hylif perfformiad uchel ar gyfer ymchwil metabolomeg. Defnyddiwch brotocol triniaeth ar hap i drin pob sampl gyda nifer tebyg o gelloedd i atal effeithiau swp. Gwnaethom asesiad ansoddol o fetabolion byd-eang a gyhoeddwyd yn flaenorol ar y Sbectromedr Màs Cwadrpol Triphlyg AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Perfformiwyd dadansoddiad cromatograffig ac integreiddio arwynebedd brig gan ddefnyddio meddalwedd MultiQuant fersiwn 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Defnyddiwyd cyfrif ïonau o 1000 i amcangyfrif y gwerth metabolyn coll, a defnyddiwyd TIC pob sampl i gyfrifo arwynebedd brig wedi'i normaleiddio pob metabolyn a ganfuwyd i gywiro am newidiadau a gyflwynwyd gan y dadansoddiad offerynnol o brosesu sampl. Ar ôl i'r TIC gael ei normaleiddio, defnyddir MetaboAnalystR(51) (paramedr diofyn) ar gyfer trosi logarithmig a graddio llinell norm awtomatig. Defnyddiwyd PCA gyda phecyn vegan R i gynnal dadansoddiad archwiliadol o wahaniaethau metabolyn rhwng mathau o samplau, a defnyddiwyd dadansoddiad diswyddiad rhannol i ddadansoddi cleifion. Defnyddiwyd dull Ward i lunio dendrogram map gwres i glystyru'r pellter Ewclidaidd rhwng samplau. Defnyddiwyd limma (52) ar helaethrwydd metabolyn safonol i nodi metabolion gwahanol yn helaeth ar draws y math celloedd cyfan a'r microamgylchedd. Er mwyn symleiddio'r esboniad, rydym yn defnyddio'r paramedr cymedr grŵp i nodi'r model, ac yn ystyried y mathau o gelloedd yn y microamgylchedd fel pob grŵp (n = 6 grŵp); Ar gyfer y prawf arwyddocâd, fe wnaethom gynnal tri mesuriad ailadroddus ar gyfer pob metabolyn. Er mwyn osgoi atgynhyrchu ffug, cafodd y claf ei gynnwys fel rhwystr yn nyluniad y limma. Er mwyn gwirio'r gwahaniaethau mewn metabolion rhwng gwahanol gleifion, fe wnaethom addasu'r model limma gan gynnwys cleifion mewn ffordd sefydlog. Rydym yn adrodd ar arwyddocâd y cyferbyniad a bennwyd ymlaen llaw rhwng y math o gell a microamgylchedd Padj <0.05 (cywiriad Benjamini-Hochberg).
Ar ôl cyfoethogi egni gan ddefnyddio Pecyn Tynnu Celloedd Marw Miltenyi (>80% hyfywedd), perfformiwyd dilyniannu trawsgriftom un gell ar gyfanswm y samplau asgites a thiwmorau wedi'u rhewi'n fyw gan ddefnyddio protocol mynegiant genyn 10x 5′. Dadansoddwyd pum achos gyda thiwmorau ac asgites cyfatebol, er bod hyfywedd isel un sampl tiwmor yn atal ei gynnwys. Er mwyn cyflawni detholiadau lluosog o gleifion, fe wnaethom gyfuno samplau pob claf yn lonydd y rheolydd cromiwm 10x, a dadansoddi safleoedd yr asgites a'r tiwmorau ar wahân. Ar ôl dilyniannu [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp pen paru (PE), genom Quebec; cyfartaledd o 73,488 a 41,378 o ddarlleniadau fesul cell ar gyfer tiwmor ac asgites yn y drefn honno]], fe wnaethom ddefnyddio CellSNP a Vireo (53) (yn seiliedig ar CellSNP fel Mae'r SNP dynol cyffredin (VCF) a ddarperir gan GRCh38 wedi'i aseinio i hunaniaeth rhoddwr. Rydym yn defnyddio SNPRelate i gasglu'r hunaniaeth agosaf (IBS) o statws genoteip y claf (IBS), ac eithrio celloedd heb eu haseinio a chelloedd a nodwyd fel deuplexau a rhoddwyr cyfatebol rhwng samplau asgites a thiwmor (54). Ar sail y dasg hon, fe wnaethom gadw tri achos gyda chynrychiolaeth gelloedd helaeth yn y tiwmor a'r asgites ar gyfer dadansoddiad i lawr yr afon. Ar ôl perfformio cam hidlo màs yn y pecynnu BioConductor scater (55) a scran (56), cynhyrchodd hyn 6975 o gelloedd (2792 a 4183 o gelloedd o diwmor ac asgites, yn y drefn honno) ar gyfer dadansoddi. Rydym yn defnyddio clystyru Louvain igraph (57) o rwydwaith cymydog agosaf a rennir (SNN) yn seiliedig ar bellter Jaccard i glwstwr celloedd trwy fynegiant. Y Cafodd clystyrau eu hanodio â llaw i fathau celloedd tybiedig yn seiliedig ar fynegiant genynnau marciwr a'u delweddu gyda t-SNE. Diffinnir celloedd T cytotocsig gan fynegiant CD8A a GZMA, ac eithrio is-glystyrau â mynegiant protein ribosomaidd isel. Fe wnaethom gael mynediad at ddata cyhoeddedig Izar et al. (16), gan gynnwys eu hymgorfforiad t-SNE, a all reoli'r gorgyffwrdd mynegiant rhwng marcwyr celloedd imiwnedd a mynegiant NNMT.
Gwahanwyd PBMC oddi wrth gynhyrchion gwahanu leukocytes (STEMCELL Technologies) trwy allgyrchu dwysedd graddiant Ficoll. Ynyswyd celloedd CD3+ o PBMC gan ddefnyddio gleiniau CD3 (Miltenyi). Ym mhresenoldeb neu absenoldeb MNA, actifadwyd celloedd CD3+ gyda CD3 wedi'i rwymo ar blât (5μg/ml), CD28 hydawdd (3μg/ml) ac IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ar ddiwrnod olaf yr ehangu, gwerthuswyd y hyfywedd (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) a'r amlhau (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) trwy cytometry llif. Gwerthuswch swyddogaeth yr effeithydd drwy ysgogi celloedd gyda PMA (20 ng/ml) ac ionomycin (1μg/ml) gyda GolgiStop am 4 awr, a monitro CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) a TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Ysgogwch gelloedd qPCR a ChIP gyda PMA (20 ng/ml) ac ionomycin (1μg/ml) am 4 awr. Casglwyd yr uwchnofiant ELISA cyn ac ar ôl ysgogi gyda PMA (20 ng/ml) ac ionomycin (1 μg/ml) am 4 awr.
Dilynwch brotocol y gwneuthurwr i ynysu RNA gan ddefnyddio Pecyn Mini RNeasy Plus (QIAGEN). Defnyddiwch QIAshredder (QIAGEN) i homogeneiddio'r sampl. Defnyddiwch becyn RNA capasiti uchel i cDNA (Thermo Fisher Scientific) i syntheseiddio DNA cyflenwol (cDNA). Defnyddiwch TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) i fesur mynegiant genynnau (yn ôl protocol y gwneuthurwr) gyda'r chwiliedyddion canlynol: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyseroldehyd-3-ffosffad oddi ar Hydrogen (GAPDH)] a Hs01010726_m1 (SLC22A2). Rhedwyd y samplau ar system PCR amser real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ym mhlât adwaith 96-ffynnon optegol cyflym MicroAmp (Applied Biosystems) gyda ffilm optegol MicroAmp. Ystyrir bod unrhyw werth Ct sy'n fwy na 35 yn uwch na'r trothwy canfod ac fe'i marciwyd fel un na ellir ei ganfod.
Perfformiwch ChIP fel y disgrifiwyd yn flaenorol (58). Yn gryno, cafodd y celloedd eu trin â fformaldehyd (crynodiad terfynol 1.42%) a'u magu ar dymheredd ystafell am 10 munud. Defnyddiwch glustog chwyddo atodol (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl a 0.1% NP-40) ar rew am 10 munud, yna ail-ataliwch mewn glustog imiwno-ddyfodiad fel y disgrifiwyd (58). Yna soniciwyd y sampl gyda'r cylchoedd canlynol: 10 cylch (20 curiad 1 eiliad) ac amser statig o 40 eiliad. Magwch wrthgyrff imiwnoglobwlin G gradd ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ac SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) gyda'r sampl ar 4°CC ac ysgwydwch dros nos. Deorwch gleiniau protein A (Thermo Fisher Scientific) gyda'r sampl ar 4°C gan ysgwyd yn ysgafn am 1 awr, yna defnyddiwch gleiniau chelex (Bio-Rad) i gyfoethogi'r DNA, a defnyddiwch broteinase K (Thermo Fisher) ar gyfer treuliad protein. Canfuwyd hyrwyddwr TNFα gan PCR: ymlaen, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; i'r gwrthwyneb, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (cynnyrch 207-bp). Cynhyrchwyd y delweddau gan Image Lab (Bio-Rad) a'u meintioli gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ.
Casglwyd uwchnofiant diwylliant celloedd fel y disgrifiwyd uchod. Cynhaliwyd y penderfyniad yn unol â gweithdrefnau'r gwneuthurwr ar gyfer pecyn ELISA TNFα dynol (Invitrogen), pecyn ELISA IL-2 dynol (Invitrogen) a phecyn ELISA IFN-γ dynol (Abcam). Yn unol â phrotocol y gwneuthurwr, gwanhawyd yr uwchnofiant 1:100 i ganfod TNFα ac IL-2, ac 1:3 i ganfod IFN-γ. Defnyddiwch Ddarllenydd Aml-label EnVision 2104 (PerkinElmer) i fesur amsugnedd ar 450 nm.
Gwahanwyd celloedd PBMC oddi wrth gynhyrchion gwahanu leukocytes (STEMCELL Technologies) trwy allgyrchu dwysedd graddiant Ficoll. Ynyswyd celloedd CD3+ o PBMC gan ddefnyddio gleiniau CD3 (Miltenyi). Ym mhresenoldeb neu absenoldeb MNA, actifadwyd celloedd CD3+ gyda CD3 wedi'i rwymo i blât (5μg/ml), CD28 hydawdd (3μg/ml) ac IL-2 (300 U/ml; Proleukin) am 3 diwrnod. Ar ôl 3 diwrnod, casglwyd y celloedd a'u golchi â halwynog 0.9%, a rhewwyd y belen yn gyflym. Perfformiwyd cyfrif celloedd trwy cytometry llif (Cytek Aurora; cyfluniad 3L-16V-14B-8R) gan ddefnyddio gleiniau e 123count.
Metabolion yr echdyniad fel y disgrifiwyd uchod. Ailgyfansoddwyd y echdyniad sych ar grynodiad o 4000 o gyfwerthoedd celloedd/μl. Dadansoddwch y sampl drwy gromatograffaeth cyfnod gwrthdro (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) a cholofn CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, maint gronynnau 1.6-μm, maint mandwll 120-Å; #186008500, Waters). Sbectromedr màs pegynol (6470, Agilent), lle mae ïoneiddio electrochwistrellu yn gweithredu mewn modd positif. Cyfnod symudol A yw 0.1% asid fformig (mewn H2O), cyfnod symudol B yw 90% asetonitril, 0.1% asid fformig. Mae graddiant yr LC rhwng 0 a 2 funud ar gyfer 100% A, 2 i 7.1 funud ar gyfer 99% B, a 7.1 i 8 munud ar gyfer 99% B. Yna ail-gydbwyswch y golofn gyda chyfnod symudol A ar gyfradd llif o 0.6 ml/munud am 3 munud. Y gyfradd llif yw 0.4ml/munud, a chynhesir siambr y golofn i 50°C. Defnyddiwch safon gemegol pur MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Gogledd Efrog, Ontario, Canada) i sefydlu amser cadw (RT) a thrawsnewidiad (RT = 0.882 munud, trawsnewidiad 1 = 137→94.1, trawsnewidiad 2 = 137→92, Trawsnewidiad 3 = 137→78). Pan fydd y tri thrawsnewidiad yn digwydd ar yr amser cadw cywir, defnyddir trawsnewidiad 1 ar gyfer meintioli i sicrhau manylder. Cynhyrchwyd cromlin safonol MNA (Toronto Research Chemical Company) gan chwe gwanhad cyfresol o'r toddiant stoc (1 mg/ml) i gael safonau o 0.1, 1.0, 10 a 100 ng/ml ac 1.0 a 10μg/ml hylif yn y drefn honno. Y terfyn canfod yw 1 ng/ml, ac mae'r ymateb llinol rhwng 10 ng/ml a 10μg/ml. Defnyddir pob pigiad o ddau ficrolitr o sampl a safon ar gyfer dadansoddiad LC/MS, a rhedeg sampl rheoli ansawdd cymysg bob wyth pigiad i sicrhau sefydlogrwydd y platfform dadansoddi. Roedd ymatebion MNA pob sampl celloedd a gafodd eu trin ag MNA o fewn yr ystod llinol o'r assay. Gwnaed dadansoddiad data gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi meintiol MassHunter (v9.0, Agilent).
Cymerwyd yr ail genhedlaeth o adeiladwaith αFR-CAR o Song et al. (59). Yn gryno, mae'r adeiladwaith yn cynnwys y cynnwys canlynol: dilyniant arweinydd CD8a, darn amrywiol cadwyn sengl penodol i αFR dynol, rhanbarth colyn a thrawsbilen CD8a, parth mewngellol CD27 a pharth mewngellol CD3z. Syntheseiddiwyd y dilyniant CAR cyflawn gan GenScript, ac yna ei glonio i'r fector mynegiant lentifirol ail genhedlaeth i fyny'r afon o'r casét mynegiant GFP a ddefnyddiwyd i werthuso effeithlonrwydd y trawsdwythiad.
Cynhyrchir lentifirws trwy drawsffurfio celloedd HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); wedi'i dyfu mewn cyfrwng Dulbecco's modified Eagle sy'n cynnwys 10% serwm ffetws buchol (FBS) ac 1% PenStrep, a defnyddiwyd fector CAR-GFP a'r plasmidau pecynnu (psPAX2 a pMD2.G, Addgene) yn defnyddio amin lipofection (Sigma-Aldrich). Casglwyd yr uwchnofant sy'n cynnwys y firws 48 a 72 awr ar ôl trawsffurfio, ei hidlo, a'i grynhoi trwy uwchganrifugio. Storiwch yr uwchnofant firaol crynodedig ar -80°C tan drawsffurfiad.
Mae PBMC yn cael eu gwahanu oddi wrth gynhyrchion gwahanu leukocytes rhoddwyr iach (STEMCELL Technologies) trwy allgyrchu dwysedd graddiant Ficoll. Defnyddiwch ficrobelenni CD8 dethol positif (Miltenyi) i ynysu celloedd CD8+ o PBMC. Ysgogwch gelloedd T gyda TransAct (Miltenyi) ac mewn cyfrwng TexMACS [Miltenyi; wedi'i ategu â 3% serwm dynol wedi'i ddadactifadu â gwres, 1% PenStrep ac IL-2 (300 U/ml)]. Bedair awr ar hugain ar ôl ysgogi, cafodd celloedd T eu trawsdwytho â lentifirws (10 μl o uwchnofaint firws crynodedig fesul 106 celloedd). 1 i 3 diwrnod ar ôl trawsdwytho ar Cytek Aurora (ar FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), gwerthuswch fynegiant GFP y celloedd i ddangos effeithlonrwydd trawsdwytho o leiaf 30%.
Cafodd celloedd CAR-T eu meithrin am 24 awr yn Immunocult (STEMCELL Technologies; wedi'i ategu ag 1% PenStrep) o dan yr amodau canlynol: heb eu trin, wedi'u trin â 250 μM adenosin neu 10 mM MNA. Ar ôl triniaeth ymlaen llaw, golchwyd celloedd CAR-T â PBS a'u cyfuno â 20,000 o gelloedd SK-OV-3 [ATCC; mewn cyfrwng McCoy 5A (Sigma-Aldrich) wedi'i ategu â 10% FBS ac 1% PenStrep ar 10: Cafodd y gymhareb effeithydd i darged o 1 ei mwyhau mewn tair copi mewn cyfrwng Immunocult wedi'i ategu. Defnyddiwyd celloedd SK-OV-3 a chelloedd SK-OV-3 wedi'u lysio â saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) fel rheolyddion negyddol a phositif, yn y drefn honno. Ar ôl 24 awr o gyd-drin, casglwyd yr uwchnofiant a mesurwyd y lactad dehydrogenase (LDH) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Kit Assay Cytotoxicity LDH Glo, Promega). Cafodd uwchnofaint LDH ei wanhau 1:50 mewn byffer LDH. Mesurwyd canran y lladd gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol: canran y lladd = canran y cywiriad / cyfradd lladd uchaf x 100%, lle mae canran y cywiriad = cyd-ddiwylliant-celloedd T yn unig, a'r gyfradd lladd uchaf = rheolaeth bositif-rheolaeth negatif.
Fel y disgrifir yn y testun neu'r deunyddiau a'r dulliau, defnyddiwch GraphPad Prism 8, Microsoft Excel neu R v3.6.0 ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Os cesglir samplau lluosog gan yr un claf (megis asgites a thiwmor), rydym yn defnyddio prawf t paru neu'n cynnwys y claf fel effaith ar hap mewn model llinol neu gyffredinol fel y bo'n briodol. Ar gyfer dadansoddiad metabolomeg, perfformir y prawf pwysigrwydd mewn tair copi.
Am ddeunyddiau atodol ar gyfer yr erthygl hon, gweler http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Mae hon yn erthygl mynediad agored a ddosberthir o dan delerau'r Drwydded Creative Commons Attribution-Non-Commercial, sy'n caniatáu'r defnydd, y dosbarthiad a'r atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng, cyn belled nad yw'r defnydd terfynol at elw masnachol a'r rhagdybiaeth yw bod y gwaith gwreiddiol yn gywir. Cyfeirnod.
Nodyn: Dim ond gofynnwn i chi ddarparu eich cyfeiriad e-bost fel bod y person rydych chi'n ei argymell i'r dudalen yn gwybod eich bod chi eisiau iddyn nhw weld yr e-bost ac nad sbam ydyw. Ni fyddwn yn casglu unrhyw gyfeiriadau e-bost.
Defnyddir y cwestiwn hwn i brofi a ydych chi'n ymwelydd ac atal cyflwyno sbam yn awtomatig.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson ( Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. (Phineas T.
Mae MNA yn cyfrannu at atal imiwnedd celloedd T ac yn cynrychioli targed imiwnotherapi posibl ar gyfer trin canser dynol.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson ( Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. (Phineas T.
Mae MNA yn cyfrannu at atal imiwnedd celloedd T ac yn cynrychioli targed imiwnotherapi posibl ar gyfer trin canser dynol.
©2021 Cymdeithas America er Hyrwyddo Gwyddoniaeth. cedwir pob hawl. Mae AAAS yn bartner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. GwyddoniaethAdvances ISSN 2375-2548.