Dangoswyd bod asid propionig (PPA), asiant gwrthffyngol ac ychwanegyn dietegol cyffredin, yn achosi niwroddatblygiad annormal mewn llygod ynghyd â chamweithrediad gastroberfeddol, a allai gael ei achosi gan dysbiosis y perfedd. Awgrymwyd cysylltiad rhwng amlygiad i PPA dietegol a dysbiosis microbiota'r perfedd, ond nid yw wedi'i ymchwilio'n uniongyrchol. Yma, fe wnaethom ymchwilio i newidiadau sy'n gysylltiedig â PPA yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd a all arwain at dysbiosis. Dilyniannwyd microbiomau perfedd llygod a fwydwyd â diet heb ei drin (n=9) a diet wedi'i gyfoethogi â PPA (n=13) gan ddefnyddio dilyniannu metagenomig hirdymor i asesu gwahaniaethau mewn cyfansoddiad microbaidd a llwybrau metabolaidd bacteriol. Roedd PPA dietegol yn gysylltiedig â chynnydd yn nifer y tacsonau arwyddocaol, gan gynnwys sawl rhywogaeth o Bacteroides, Prevotella, a Ruminococcus, y mae aelodau ohonynt wedi'u cysylltu o'r blaen â chynhyrchu PPA. Roedd gan ficrobiomau llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA fwy o lwybrau sy'n gysylltiedig â metaboledd lipid a biosynthesis hormonau steroid hefyd. Mae ein canlyniadau'n dangos y gall PPA newid microbiota'r perfedd a'i lwybrau metabolaidd cysylltiedig. Mae'r newidiadau a welwyd yn tynnu sylw at y ffaith y gall cadwolion sydd wedi'u dosbarthu fel rhai diogel i'w bwyta ddylanwadu ar gyfansoddiad microbiota'r perfedd ac, yn ei dro, ar iechyd pobl.
Cyfeirir yn aml at y microbiom dynol fel "organ olaf y corff" ac mae'n chwarae rhan hanfodol yn iechyd dynol (Baquero a Nombela, 2012). Yn benodol, mae'r microbiom perfedd yn cael ei gydnabod am ei ddylanwad ar draws y system a'i rôl mewn llawer o swyddogaethau hanfodol. Mae bacteria commensal yn doreithiog yn y perfedd, gan feddiannu cilfachau ecolegol lluosog, gan ddefnyddio maetholion, a chystadlu â phathogenau posibl (Jandhyala et al., 2015). Mae cydrannau bacteriol amrywiol o ficrobiota'r perfedd yn gallu cynhyrchu maetholion hanfodol fel fitaminau a hyrwyddo treuliad (Rowland et al., 2018). Dangoswyd hefyd fod metabolion bacteriol yn dylanwadu ar ddatblygiad meinwe ac yn gwella llwybrau metabolaidd ac imiwnedd (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Mae cyfansoddiad microbiom perfedd dynol yn hynod amrywiol ac yn dibynnu ar ffactorau genetig ac amgylcheddol fel diet, rhyw, meddyginiaethau, a statws iechyd (Kumbhare et al., 2019).
Mae diet mamol yn elfen hanfodol o ddatblygiad y ffetws a'r newydd-anedig ac yn ffynhonnell dybiedig o gyfansoddion a all ddylanwadu ar ddatblygiad (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Un cyfansoddyn o'r fath o ddiddordeb yw asid propionig (PPA), sgil-gynnyrch asid brasterog cadwyn fer a geir o eplesu bacteriol ac ychwanegyn bwyd (den Besten et al., 2013). Mae gan PPA briodweddau gwrthfacteria a gwrthffyngol ac felly fe'i defnyddir fel cadwolyn bwyd ac mewn cymwysiadau diwydiannol i atal twf llwydni a bacteria (Wemmenhove et al., 2016). Mae gan PPA effeithiau gwahanol mewn gwahanol feinweoedd. Yn yr afu, mae gan PPA effeithiau gwrthlidiol trwy effeithio ar fynegiant cytocin mewn macroffagau (Kawasoe et al., 2022). Mae'r effaith reoleiddiol hon hefyd wedi'i harsylwi mewn celloedd imiwnedd eraill, gan arwain at leihau llid (Haase et al., 2021). Fodd bynnag, mae'r effaith gyferbyniol wedi'i harsylwi yn yr ymennydd. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod amlygiad i PPA yn achosi ymddygiad tebyg i awtistiaeth mewn llygod (El-Ansary et al., 2012). Mae astudiaethau eraill wedi dangos y gall PPA achosi gliosis ac actifadu llwybrau pro-llidiol yn yr ymennydd (Abdelli et al., 2019). Gan fod PPA yn asid gwan, gall dryledu trwy'r epitheliwm berfeddol i'r llif gwaed ac felly groesi rhwystrau cyfyngol gan gynnwys y rhwystr gwaed-ymennydd yn ogystal â'r plasenta (Stinson et al., 2019), gan dynnu sylw at bwysigrwydd PPA fel metabolyn rheoleiddiol a gynhyrchir gan facteria. Er bod rôl bosibl PPA fel ffactor risg ar gyfer awtistiaeth yn cael ei hymchwilio ar hyn o bryd, gall ei effeithiau ar unigolion ag awtistiaeth ymestyn y tu hwnt i ysgogi gwahaniaethu niwral.
Mae symptomau gastroberfeddol fel dolur rhydd a rhwymedd yn gyffredin mewn cleifion ag anhwylderau niwroddatblygiadol (Cao et al., 2021). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod microbiom cleifion ag anhwylderau sbectrwm awtistiaeth (ASD) yn wahanol i ficrobiom unigolion iach, gan awgrymu presenoldeb dysbiosis microbiota'r perfedd (Finegold et al., 2010). Yn yr un modd, mae nodweddion microbiom cleifion â chlefydau llidiol y coluddyn, gordewdra, clefyd Alzheimer, ac ati hefyd yn wahanol i rai unigolion iach (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Fodd bynnag, hyd yn hyn, ni sefydlwyd unrhyw berthynas achosol rhwng microbiom y perfedd a chlefydau neu symptomau niwrolegol (Yap et al., 2021), er y credir bod sawl rhywogaeth bacteriol yn chwarae rhan yn rhai o'r cyflyrau clefyd hyn. Er enghraifft, mae Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio a genynnau eraill yn fwy niferus ym microbiota cleifion ag awtistiaeth (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Yn arbennig, gwyddys bod rhywogaethau sy'n aelodau o rai o'r genynnau hyn yn meddu ar enynnau sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA (Reichardt et al., 2014; Yun a Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur a Dürre, 2023). O ystyried priodweddau gwrthficrobaidd PPA, gall cynyddu ei nifer fod o fudd i dwf bacteria sy'n cynhyrchu PPA (Jacobson et al., 2018). Felly, gall amgylchedd sy'n llawn PFA arwain at newidiadau ym microbiota'r perfedd, gan gynnwys pathogenau gastroberfeddol, a all fod yn ffactorau posibl sy'n arwain at symptomau gastroberfeddol.
Un o'r cwestiynau canolog mewn ymchwil i ficrobiomau yw a yw gwahaniaethau yng nghyfansoddiad microbaidd yn achos neu'n symptom o glefydau sylfaenol. Y cam cyntaf tuag at egluro'r berthynas gymhleth rhwng diet, microbiom y perfedd, a chlefydau niwrolegol yw asesu effeithiau diet ar gyfansoddiad microbaidd. I'r perwyl hwn, fe wnaethom ddefnyddio dilyniannu metagenomig darllen hir i gymharu microbiomau perfedd epil llygod a fwydwyd diet cyfoethog mewn PPA neu ddeiet heb lawer o PPA. Bwydwyd yr un diet â'u mamau i'r epil. Gwnaethom ragdybio y byddai diet cyfoethog mewn PPA yn arwain at newidiadau yng nghyfansoddiad microbaidd y perfedd a llwybrau swyddogaethol microbaidd, yn enwedig y rhai sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA a/neu gynhyrchu PPA.
Defnyddiodd yr astudiaeth hon lygod trawsgenig FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) sy'n gor-fynegi protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) o dan reolaeth yr hyrwyddwr GFAP penodol i glia yn dilyn canllawiau Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Canolbarth Florida (UCF-IACUC) (Rhif Trwydded Defnydd Anifeiliaid: PROTO202000002). Ar ôl diddyfnu, cafodd llygod eu lletya'n unigol mewn cewyll gydag 1-5 llygoden o bob rhyw fesul cawell. Bwydwyd llygod yn ôl y galw gyda naill ai diet rheoli wedi'i buro (diet safonol label agored wedi'i addasu, 16 kcal% braster) neu ddeiet wedi'i ategu â sodiwm propionad (diet safonol label agored wedi'i addasu, 16 kcal% braster, yn cynnwys 5,000 ppm sodiwm propionad). Roedd faint o sodiwm propionad a ddefnyddiwyd yn cyfateb i 5,000 mg o PFA/kg o gyfanswm pwysau bwyd. Dyma'r crynodiad uchaf o PPA a gymeradwywyd i'w ddefnyddio fel cadwolyn bwyd. I baratoi ar gyfer yr astudiaeth hon, bwydwyd llygod rhiant â'r ddau ddeiet am 4 wythnos cyn paru a pharhawyd â hynny drwy gydol beichiogrwydd y fam. Diddyfnwyd llygod epil [22 o lygoden, 9 rheolydd (6 gwryw, 3 benyw) a 13 PPA (4 gwryw, 9 benyw)] ac yna parhawyd â'r un diet â'r mamau am 5 mis. Aberthwyd llygod epil yn 5 mis oed a chasglwyd cynnwys eu carthion berfeddol a'i storio i ddechrau mewn tiwbiau microcentrifuge 1.5 ml ar -20°C ac yna ei drosglwyddo i rewgell -80°C nes bod DNA'r gwesteiwr wedi'i ddisbyddu ac asidau niwclëig microbaidd wedi'u tynnu.
Tynnwyd DNA'r gwesteiwr yn unol â phrotocol wedi'i addasu (Charalampous et al., 2019). Yn gryno, trosglwyddwyd cynnwys y fecal i 500 µl o InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) a'i storio wedi'i rewi. Proseswch uchafswm o 1-2 belen fecal fesul echdynnu. Yna homogeneiddiwyd cynnwys y fecal yn fecanyddol gan ddefnyddio pestl plastig y tu mewn i'r tiwb i ffurfio slyri. Allgyrchwch y samplau ar 10,000 RCF am 5 munud neu nes bod y samplau wedi pelennu, yna sugnwch yr uwchnofiant ac ail-atalydd y belen mewn 250 µl o 1× PBS. Ychwanegwch 250 µl o doddiant saponin 4.4% (TCI, rhif cynnyrch S0019) at y sampl fel glanedydd i lacio pilenni celloedd ewcariotig. Cymysgwyd y samplau'n ysgafn nes eu bod yn llyfn a'u deori ar dymheredd ystafell am 10 munud. Nesaf, i amharu ar gelloedd ewcariotig, ychwanegwyd 350 μl o ddŵr heb niwcleas at y sampl, a'i ddeori am 30 eiliad, ac yna ychwanegwyd 12 μl o 5 M NaCl. Yna cafodd y samplau eu centrifugio ar 6000 RCF am 5 munud. Anadlu'r uwchnofiant ac ail-atal y belen mewn 100 μl o 1X PBS. I gael gwared ar DNA'r gwesteiwr, ychwanegwch 100 μl o fyffer HL-SAN (12.8568 g o NaCl, 4 ml o 1M MgCl2, 36 ml o ddŵr heb niwcleas) a 10 μl o ensym HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Cymysgwyd y samplau'n drylwyr trwy bibedu a'u magu ar 37 °C am 30 munud ar 800 rpm ar Eppendorf™ ThermoMixer C. Ar ôl magu, cawsant eu centrifugio ar 6000 RCF am 3 munud a'u golchi ddwywaith gydag 800 µl a 1000 µl 1X PBS. Yn olaf, ail-atalyddwch y belen mewn 100 µl 1X PBS.
Ynyswyd cyfanswm y DNA bacteriol gan ddefnyddio Pecyn Puro DNA Genomig Monarch New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Mae'r weithdrefn weithredu safonol a ddarperir gyda'r pecyn wedi'i haddasu ychydig. Deorwch a chadwch ddŵr heb niwcleas ar 60°C cyn ei weithredu ar gyfer yr elution terfynol. Ychwanegwch 10 µl o Proteinase K a 3 µl o RNase A at bob sampl. Yna ychwanegwch 100 µl o Glust Lysis Celloedd a chymysgwch yn ysgafn. Yna deorwyd y samplau mewn Eppendorf™ ThermoMixer C ar 56°C a 1400 rpm am o leiaf 1 awr a hyd at 3 awr. Cafodd y samplau a ddeorwyd eu centrifugio ar 12,000 RCF am 3 munud a throsglwyddwyd yr uwchnofiant o bob sampl i diwb microcentrifuge 1.5 mL ar wahân yn cynnwys 400 µL o doddiant rhwymo. Yna cafodd y tiwbiau eu vortecsio â phwls am 5–10 eiliad ar gyfnodau o 1 eiliad. Trosglwyddwch gynnwys hylif cyfan pob sampl (tua 600–700 µL) i getris hidlo wedi'i osod mewn tiwb casglu llif-drwodd. Cafodd y tiwbiau eu centrifugio ar 1,000 RCF am 3 munud i ganiatáu rhwymo DNA cychwynnol ac yna eu centrifugio ar 12,000 RCF am 1 funud i gael gwared ar hylif gweddilliol. Trosglwyddwyd y golofn sampl i diwb casglu newydd ac yna ei golchi ddwywaith. Ar gyfer y golchiad cyntaf, ychwanegwch 500 µL o fyffer golchi i bob tiwb. Trowch y tiwb wyneb i waered 3–5 gwaith ac yna centrifugio ar 12,000 RCF am 1 funud. Taflwch yr hylif o'r tiwb casglu a rhowch y getris hidlo yn ôl i'r un tiwb casglu. Ar gyfer yr ail golchiad, ychwanegwch 500 µL o fyffer golchi i'r hidlydd heb ei droi wyneb i waered. Cafodd y samplau eu centrifugio ar 12,000 RCF am 1 funud. Trosglwyddwch yr hidlydd i diwb LoBind® 1.5 mL ac ychwanegwch 100 µL o ddŵr heb niwcleas wedi'i gynhesu ymlaen llaw. Cafodd yr hidlwyr eu magu ar dymheredd ystafell am 1 funud ac yna eu centrifugio ar 12,000 RCF am 1 funud. Cafodd y DNA wedi'i elutio ei storio ar -80°C.
Mesurwyd crynodiad DNA gan ddefnyddio Fflworomedr Qubit™ 4.0. Paratowyd DNA gan ddefnyddio'r Pecyn Sensitifrwydd Uchel Qubit™ 1X dsDNA (Rhif Cat. Q33231) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mesurwyd dosbarthiad hyd darn DNA gan ddefnyddio Aglient™ 4150 neu 4200 TapeStation. Paratowyd DNA gan ddefnyddio Adweithyddion DNA Genomic Agilent™ (Rhif Cat. 5067-5366) a Genomic DNA ScreenTape (Rhif Cat. 5067-5365). Perfformiwyd paratoi llyfrgell gan ddefnyddio'r Pecyn Barcodio PCR Cyflym Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Dilyniannwyd DNA gan ddefnyddio dilyniannwr ONT GridION™ Mk1 gyda chell llif Min106D (R 9.4.1). Y gosodiadau dilyniannu oedd: galw sylfaen cywirdeb uchel, gwerth q lleiaf o 9, gosod cod bar, a thocio cod bar. Dilyniannwyd samplau am 72 awr, ac ar ôl hynny cyflwynwyd data galwadau sylfaenol i'w prosesu a'u dadansoddi ymhellach.
Perfformiwyd prosesu biowybodeg gan ddefnyddio dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol (Greenman et al., 2024). Rhannwyd y ffeiliau FASTQ a gafwyd o ddilyniannu yn gyfeiriaduron ar gyfer pob sampl. Cyn dadansoddi biowybodeg, proseswyd y data gan ddefnyddio'r biblinell ganlynol: yn gyntaf, unwyd ffeiliau FASTQ y samplau yn un ffeil FASTQ. Yna, hidlwyd darlleniadau byrrach na 1000 bp gan ddefnyddio Filtlong v. 0.2.1, gyda'r unig baramedr a newidiwyd yn –min_length 1000 (Wick, 2024). Cyn hidlo ymhellach, rheolwyd ansawdd y darlleniad gan ddefnyddio NanoPlot v. 1.41.3 gyda'r paramedrau canlynol: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster a Rademakers, 2023). Cafodd darlleniadau eu halinio â genom cyfeirio'r llygoden GRCm39 (GCF_000001635.27) gan ddefnyddio minimap2 v. 2.24-r1122 i gael gwared ar ddarlleniadau wedi'u halogi gan y gwesteiwr gyda'r paramedrau canlynol: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Cafodd y ffeiliau aliniad a gynhyrchwyd eu trosi i fformat BAM gan ddefnyddio samtools view -b (Danecek et al., 2021) yn samtools v. 1.16.1. Yna nodwyd darlleniadau heb eu halinio gan ddefnyddio samtools view -b -f 4, gan ddangos nad oedd y darlleniadau hyn yn perthyn i genom y gwesteiwr. Cafodd darlleniadau heb eu halinio eu trosi yn ôl i fformat FASTQ gan ddefnyddio samtools bam2fq gyda pharamedrau diofyn. Ail-redegwyd NanoPlot ar y darlleniadau wedi'u hidlo pellach gan ddefnyddio'r gosodiadau a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Ar ôl hidlo, casglwyd data metagenomig gan ddefnyddio metaflye v. 2.8.2-b1689 gyda'r paramedrau canlynol: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). Gadewch y paramedrau sy'n weddill ar eu gwerthoedd diofyn. Ar ôl y cydosodiad, mapiwyd y darlleniadau wedi'u hidlo i'r cydosodiad gan ddefnyddio minimap2, a defnyddiwyd y paramedr -ax map-ont i gynhyrchu ffeil alinio ar ffurf SAM. Mireiniwyd y cydosodiad yn gyntaf gan ddefnyddio racon v. 1.4.20 gyda'r paramedrau canlynol: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Ar ôl cwblhau racon, cafodd ei fireinio ymhellach gyda medaka v. 1.7.2, gan ddefnyddio medaka_consesus, gyda phob paramedr ac eithrio'r paramedr -m wedi'i adael ar eu gwerthoedd diofyn. Mae'r paramedr -m wedi'i osod i r941_min_hac_g507 i nodi cemeg y gell llif a'r galwad sylfaen cywirdeb uchel a ddefnyddir ar gyfer ein data (nanoporetech/medaka, 2024). Defnyddiwyd y data wedi'i hidlo (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel data microbaidd) a'r cydosodiad wedi'i lanhau terfynol ar gyfer dadansoddiad dilynol.
Ar gyfer dosbarthu tacsonomig, dosbarthwyd darlleniadau a chontigau wedi'u cydosod gan ddefnyddio Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Cynhyrchwch adroddiadau a ffeiliau allbwn ar gyfer darlleniadau a chynulliadau, yn y drefn honno. Defnyddiwch yr opsiwn –use-names i ddadansoddi darlleniadau a chynulliadau. Nodir yr opsiynau –gzip-compressed a –paired ar gyfer segmentau darllen. Amcangyfrifwyd nifer gymharol tacsa mewn metagenomes gan ddefnyddio Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Yn gyntaf, fe greon ni gronfa ddata kmer yn cynnwys 1000 o ganolfannau gan ddefnyddio bracken-build gyda'r paramedrau canlynol: -d-k 35 -l 1000 Ar ôl ei adeiladu, mae bracken yn rhedeg yn seiliedig ar yr adroddiad a gynhyrchwyd gan kraken2 ac yn hidlo'r data gan ddefnyddio'r opsiynau canlynol: -d -I -O-p 1000 -l

Yn eu plith, dewisir P, G neu S yn dibynnu ar y lefel dosbarthu sy'n cael ei dadansoddi. Er mwyn lleihau effaith dosbarthiadau positif ffug, mabwysiadwyd trothwy digonedd cymharol lleiaf o 1e-4 (1/10,000 o ddarlleniadau). Cyn dadansoddiad ystadegol, trawsnewidiwyd y digoneddau cymharol a adroddwyd gan Bracken (fraction_total_reads) gan ddefnyddio'r trawsnewidiad cymhareb log canolog (CLR) (Aitchison, 1982). Dewiswyd y dull CLR ar gyfer trawsnewid data oherwydd ei fod yn ddigyfnewid o ran graddfa ac yn ddigonol ar gyfer setiau data nad ydynt yn brin (Gloor et al., 2017). Mae'r trawsnewidiad CLR yn defnyddio'r logarithm naturiol. Normaleiddiwyd y data cyfrif a adroddwyd gan Bracken gan ddefnyddio'r mynegiant log cymharol (RLE) (Anders a Huber, 2010). Cynhyrchwyd ffigurau gan ddefnyddio cyfuniad o matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 a logarithmau dilyniannol (Gloor et al., 2017). 0.12.2 a stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Cyfrifwyd cymhareb Bacillus/Bacteroidetes ar gyfer pob sampl gan ddefnyddio cyfrifiadau bacteriol wedi'u normaleiddio. Mae'r gwerthoedd a adroddir yn y tablau wedi'u talgrynnu i 4 lle degol. Cyfrifwyd mynegai amrywiaeth Simpson gan ddefnyddio'r sgript alpha_diversity.py a ddarperir yn y pecyn KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Darperir adroddiad Bracken yn y sgript a darperir mynegai Simpson “Si” ar gyfer y paramedr -an. Diffinwyd gwahaniaethau arwyddocaol mewn helaethrwydd fel gwahaniaethau CLR cymedrig ≥ 1 neu ≤ -1. Mae gwahaniaeth CLR cymedrig o ±1 yn dynodi cynnydd o 2.7 gwaith yn helaethrwydd math o sampl. Mae'r arwydd (+/-) yn dynodi a yw'r tacson yn fwy niferus yn y sampl PPA a'r sampl rheoli, yn y drefn honno. Penderfynwyd ar arwyddocâd gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Defnyddiwyd Statsmodels v. 0.14 (Benjamini a Hochberg, 1995; Seabold a Perktold, 2010), a chymhwyswyd y weithdrefn Benjamini-Hochberg i gywiro ar gyfer profion lluosog. Defnyddiwyd gwerth-p wedi'i addasu ≤ 0.05 fel y trothwy ar gyfer pennu arwyddocâd ystadegol.
Perfformiwyd anodiad genynnau ac amcangyfrif helaethrwydd cymharol gan ddefnyddio fersiwn wedi'i haddasu o'r protocol a ddisgrifiwyd gan Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Yn gyntaf, tynnwyd contigs byrrach na 500 bp o bob cynulliad gan ddefnyddio SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Yna cyfunwyd y cynulliadau a ddewiswyd yn fetagenome cyfan. Nodwyd fframiau darllen agored (ORFs) gan ddefnyddio Prodigal v. 1.0.1 (fersiwn gyfochrog o Prodigal v. 2.6.3) gyda'r paramedrau canlynol: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Yna hidlwyd y ffeiliau niwcleotid canlyniadol gan ddefnyddio Python i gael gwared ar yr holl enynnau anghyflawn. Yna defnyddiwyd CD-HIT v. 4.8.1 i glystyru'r genynnau gyda'r paramedrau canlynol: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Defnyddiwyd y catalog genynnau di-ddiangen a gynhyrchwyd i amcangyfrif nifer ac anodiad genynnau. Amcangyfrifwyd nifer cymharol genynnau gan ddefnyddio KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018). Yn gyntaf, crëwch ffeil mynegai gan ddefnyddio mynegai KMA gyda'r paramedrau canlynol: -i -OYna, gan ddefnyddio'r mynegai a gynhyrchwyd ynghyd â'r darlleniadau microbaidd ar gyfer pob sampl fel y disgrifir yn yr adran Piblinell Biowybodeg, rhedwyd KMA gyda'r paramedrau canlynol: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Yna, normaleiddiwyd cyfrifon genynnau gan ddefnyddio CLR, a defnyddiwyd dosbarth dadansoddi cydrannau pennaf (PCA) Sci-kit learn (Pedregosa et al., 2011). Perfformiwyd yr anodiad genynnau a ragfynegwyd ar y catalog genynnau nad yw'n ddiangen gan ddefnyddio'r sgript emapper.py o eggNOG v. 2.1.12 a chronfa ddata eggNOG fersiwn 5.0.2 gyda'r paramedrau canlynol: –itype CDS –cpu 24 -i– Catalog data–go_evidence Allbwn nad yw'n electronig– Cyfeiriadur allbwn–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –dros_director(Cantalapiedra et al., 2021). Cafodd canlyniadau'r KMA eu sgrinio i ddewis genynnau â digon o orchudd templed ac hunaniaeth templed (≥ 90%) a helaethrwydd (dyfnder ≥ 3). Cafodd canlyniadau dyfnder y KMA eu trawsnewid gan ddefnyddio CLR fel y disgrifiwyd uchod. Yna cymharwyd canlyniadau'r KMA â'r IDau contig o'r canlyniadau anodiad a dosbarthu swyddogaethol gan ddefnyddio'r ffynhonnell contig ar gyfer pob genyn. Fel gyda thacsa, diffinwyd gwahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd genynnau fel genynnau â gwahaniaeth CLR cymedrig ≥ 1 neu ≤ -1, gydag arwydd (+/-) yn nodi bod y genyn yn fwy niferus yn y samplau PPA neu reoli, yn y drefn honno.
Yn gyntaf, grwpiwyd genynnau yn ôl dynodwyr ortholog (KO) Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG) a neilltuwyd gan eggNOG i gymharu helaethrwydd llwybrau genynnau. Tynnwyd genynnau heb knockouts neu enynnau â knockouts lluosog cyn dadansoddi. Yna cyfrifwyd helaethrwydd cyfartalog pob KO fesul sampl a pherfformiwyd dadansoddiad ystadegol. Diffinwyd genynnau metaboledd PPA fel unrhyw enyn a neilltuwyd rhes ko00640 iddo yng ngholofn KEGG_Pathway, gan nodi rôl mewn metaboledd propionad yn ôl KEGG. Rhestrir genynnau a nodwyd fel rhai sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA yn Nhabl Atodol 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Perfformiwyd profion permutation i nodi genynnau metaboledd a chynhyrchu PPA a oedd yn sylweddol fwy niferus ym mhob math o sampl. Perfformiwyd mil o bermutations ar gyfer pob genyn a ddadansoddwyd. Defnyddiwyd gwerth-p o 0.05 fel torbwynt i bennu arwyddocâd ystadegol. Neilltuwyd anodiadau swyddogaethol i enynnau unigol o fewn clwstwr yn seiliedig ar anodiadau genynnau cynrychioliadol o fewn y clwstwr. Gellid adnabod tacsa sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA a/neu gynhyrchu PPA trwy baru IDau contig yn ffeiliau allbwn Kraken2 â'r un IDau contig a gedwir yn ystod anodiad swyddogaethol gan ddefnyddio eggNOG. Perfformiwyd profion arwyddocâd gan ddefnyddio'r prawf Mann-Whitney U a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Perfformiwyd cywiriad ar gyfer profion lluosog gan ddefnyddio'r weithdrefn Benjamini-Hochberg. Defnyddiwyd gwerth-p o ≤ 0.05 fel torbwynt i bennu arwyddocâd ystadegol.
Aseswyd amrywiaeth microbiom perfedd llygod gan ddefnyddio mynegai amrywiaeth Simpson. Ni welwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng y samplau rheoli a PPA o ran amrywiaeth genws a rhywogaethau (gwerth-p ar gyfer genws: 0.18, gwerth-p ar gyfer rhywogaethau: 0.16) (Ffigur 1). Yna cymharwyd cyfansoddiad microbaidd gan ddefnyddio dadansoddiad cydrannau prif (PCA). Mae Ffigur 2 yn dangos clystyru samplau yn ôl eu ffyla, sy'n dangos bod gwahaniaethau yng nghyfansoddiad rhywogaethau'r microbiomau rhwng y samplau PPA a rheoli. Roedd y clystyru hwn yn llai amlwg ar lefel y genws, gan awgrymu bod PPA yn effeithio ar rai bacteria (Ffig. Atodol 1).
Ffigur 1. Amrywiaeth alffa o genera a chyfansoddiad rhywogaethau microbiom perfedd y llygoden. Plotiau bocs yn dangos mynegeion amrywiaeth Simpson o genera (A) a rhywogaethau (B) mewn samplau PPA a rheoli. Penderfynwyd ar arwyddocâd gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney U, a pherfformiwyd cywiriad lluosog gan ddefnyddio'r weithdrefn Benjamini-Hochberg. ns, nid oedd y gwerth-p yn arwyddocaol (p>0.05).
Ffigur 2. Canlyniadau dadansoddiad prif gydrannau cyfansoddiad microbiom perfedd y llygoden ar lefel y rhywogaeth. Mae plot y dadansoddiad prif gydrannau yn dangos dosbarthiad y samplau ar draws eu dau brif gydran gyntaf. Mae lliwiau'n dynodi'r math o sampl: mae llygod sydd wedi'u hamlygu i PPA yn borffor a llygod rheoli yn felyn. Mae prif gydrannau 1 a 2 wedi'u plotio ar yr echelin-x a'r echelin-y, yn y drefn honno, ac fe'u mynegir fel eu cymhareb amrywiant esboniedig.
Gan ddefnyddio data cyfrif wedi'i drawsnewid gan RLE, gwelwyd gostyngiad sylweddol yng nghymhareb ganolrif Bacteroidetes/Bacilli mewn llygod rheoli a PPA (rheolaeth: 9.66, PPA: 3.02; gwerth-p = 0.0011). Roedd y gwahaniaeth hwn oherwydd nifer uwch o Bacteroidetes mewn llygod PPA o'i gymharu â rheolyddion, er nad oedd y gwahaniaeth yn arwyddocaol (CLR cymedrig rheoli: 5.51, CLR cymedrig PPA: 6.62; gwerth-p = 0.054), tra bod nifer yr Bacteroidetes yn debyg (CLR cymedrig rheoli: 7.76, CLR cymedrig PPA: 7.60; gwerth-p = 0.18).
Datgelodd dadansoddiad o helaethrwydd aelodau tacsonomig microbiom y coluddyn fod 1 ffylwm a 77 rhywogaeth yn wahanol iawn rhwng samplau PPA a samplau rheoli (Tabl Atodol 2). Roedd helaethrwydd 59 rhywogaeth mewn samplau PPA yn sylweddol uwch nag yn y samplau rheoli, tra bod helaethrwydd dim ond 16 rhywogaeth mewn samplau rheoli yn uwch nag yn y samplau PPA (Ffigur 3).
Ffigur 3. Gwahaniaethol niferoedd tacsa ym microbiom perfedd llygod PPA a llygod rheoli. Mae plotiau llosgfynydd yn dangos gwahaniaethau yn niferoedd y genera (A) neu'r rhywogaethau (B) rhwng samplau PPA a rheoli. Mae dotiau llwyd yn dangos nad oes gwahaniaeth arwyddocaol yn niferoedd y tacsa. Mae dotiau lliw yn dangos gwahaniaethau arwyddocaol mewn niferoedd (gwerth-p ≤ 0.05). Dangosir yr 20 tacsa uchaf gyda'r gwahaniaethau mwyaf mewn niferoedd rhwng mathau o samplau mewn coch a glas golau (samplau rheoli a PPA), yn y drefn honno. Roedd dotiau melyn a phorffor o leiaf 2.7 gwaith yn fwy niferus mewn samplau rheoli neu PPA nag mewn rheolyddion. Mae dotiau du yn cynrychioli tacsa gyda niferoedd sylweddol wahanol, gyda gwahaniaethau CLR cymedrig rhwng -1 ac 1. Cyfrifwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney U a'u cywiro ar gyfer profion lluosog gan ddefnyddio'r weithdrefn Benjamini-Hochberg. Mae gwahaniaethau CLR cymedrig trwm yn dangos gwahaniaethau arwyddocaol mewn niferoedd.
Ar ôl dadansoddi cyfansoddiad microbaidd y coluddyn, fe wnaethom ni gynnal anodiad swyddogaethol o'r microbiom. Ar ôl hidlo genynnau o ansawdd isel allan, nodwyd cyfanswm o 378,355 o enynnau unigryw ar draws yr holl samplau. Defnyddiwyd helaethrwydd trawsnewidiol y genynnau hyn ar gyfer dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA), a dangosodd y canlyniadau radd uchel o glystyru mathau o samplau yn seiliedig ar eu proffiliau swyddogaethol (Ffigur 4).
Ffigur 4. Canlyniadau PCA gan ddefnyddio proffil swyddogaethol microbiom perfedd y llygoden. Mae plot y PCA yn dangos dosbarthiad y samplau ar draws eu dau brif gydran gyntaf. Mae lliwiau'n dynodi'r math o sampl: mae llygod sydd wedi'u hamlygu i PPA yn borffor a llygod rheoli yn felyn. Mae prif gydrannau 1 a 2 wedi'u plotio ar yr echelin-x a'r echelin-y, yn y drefn honno, ac fe'u mynegir fel eu cymhareb amrywiant esboniedig.
Nesaf, archwiliwyd nifer y cnociadau KEGG mewn gwahanol fathau o samplau. Nodwyd cyfanswm o 3648 o gnociadau unigryw, ac roedd 196 ohonynt yn sylweddol fwy niferus mewn samplau rheoli a 106 yn fwy niferus mewn samplau PPA (Ffigur 5). Canfuwyd cyfanswm o 145 o enynnau mewn samplau rheoli a 61 o enynnau mewn samplau PPA, gyda niferoedd gwahanol iawn. Roedd llwybrau sy'n gysylltiedig â metaboledd lipid ac aminosiwgr wedi'u cyfoethogi'n sylweddol fwy mewn samplau PPA (Tabl Atodol 3). Roedd llwybrau sy'n gysylltiedig â metaboledd nitrogen a systemau ras gyfnewid sylffwr wedi'u cyfoethogi'n sylweddol fwy mewn samplau rheoli (Tabl Atodol 3). Roedd nifer y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd aminosiwgr/niwcleotid (ko:K21279) a metaboledd ffosffad inositol (ko:K07291) yn sylweddol uwch mewn samplau PPA (Ffigur 5). Roedd gan samplau rheoli lawer mwy o enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd bensoad (ko:K22270), metaboledd nitrogen (ko:K00368), a glycolysis/glwconeogenesis (ko:K00131) (Ffigur 5).
Ffig. 5. Gwahaniaethol niferoedd KO ym microbiom perfedd llygod PPA a llygod rheoli. Mae'r plot llosgfynydd yn darlunio'r gwahaniaethau yn niferoedd y grwpiau swyddogaethol (KOs). Mae dotiau llwyd yn dynodi KOs nad oedd eu niferoedd yn wahanol iawn rhwng mathau o samplau (gwerth-p > 0.05). Mae dotiau lliw yn dynodi gwahaniaethau sylweddol mewn niferoedd (gwerth-p ≤ 0.05). Dangosir yr 20 KO gyda'r gwahaniaethau mwyaf mewn niferoedd rhwng mathau o samplau mewn coch a glas golau, sy'n cyfateb i samplau rheoli a PPA, yn y drefn honno. Mae dotiau melyn a phorffor yn dynodi KOs a oedd o leiaf 2.7 gwaith yn fwy niferus mewn samplau rheoli a PPA, yn y drefn honno. Mae dotiau du yn dynodi KOs gyda niferoedd gwahanol iawn, gyda gwahaniaethau CLR cymedrig rhwng -1 ac 1. Cyfrifwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney U ac addaswyd ar gyfer cymhariaethau lluosog gan ddefnyddio'r weithdrefn Benjamini-Hochberg. Mae NaN yn dynodi nad yw'r KO yn perthyn i lwybr yn KEGG. Mae gwerthoedd gwahaniaeth CLR cymedrig trwm yn dynodi gwahaniaethau sylweddol mewn niferoedd. Am wybodaeth fanwl am y llwybrau y mae'r KOs a restrir yn perthyn iddynt, gweler Tabl Atodol 3.
Ymhlith y genynnau wedi'u hanodio, roedd gan 1601 o enynnau niferoedd gwahanol iawn rhwng mathau o samplau (p ≤ 0.05), gyda phob genyn o leiaf 2.7 gwaith yn fwy niferus. O'r genynnau hyn, roedd 4 genyn yn fwy niferus mewn samplau rheoli ac roedd 1597 o enynnau yn fwy niferus mewn samplau PPA. Gan fod gan PPA briodweddau gwrthficrobaidd, archwiliwyd niferoedd genynnau metaboledd a chynhyrchu PPA rhwng mathau o samplau. Ymhlith y 1332 o enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA, roedd 27 o enynnau yn sylweddol fwy niferus mewn samplau rheoli ac roedd 12 o enynnau yn fwy niferus mewn samplau PPA. Ymhlith y 223 o enynnau sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA, roedd 1 genyn yn sylweddol fwy niferus mewn samplau PPA. Mae Ffigur 6A yn dangos ymhellach y nifer uwch o enynnau sy'n ymwneud â metaboledd PPA, gyda nifer sylweddol uwch mewn samplau rheoli a meintiau effaith mawr, tra bod Ffigur 6B yn tynnu sylw at enynnau unigol gyda nifer sylweddol uwch a welwyd mewn samplau PPA.
Ffig. 6. Gwahaniaethol niferoedd genynnau sy'n gysylltiedig â PPA ym microbiom perfedd y llygoden. Mae plotiau llosgfynydd yn darlunio'r gwahaniaethau yn niferoedd y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA (A) a chynhyrchu PPA (B). Mae dotiau llwyd yn dynodi genynnau nad oedd eu niferoedd yn wahanol iawn rhwng mathau o samplau (gwerth-p > 0.05). Mae dotiau lliw yn dynodi gwahaniaethau sylweddol mewn niferoedd (gwerth-p ≤ 0.05). Dangosir yr 20 genyn gyda'r gwahaniaethau mwyaf mewn niferoedd mewn coch a glas golau (samplau rheoli a PPA), yn y drefn honno. Roedd niferoedd y dotiau melyn a phorffor o leiaf 2.7 gwaith yn fwy mewn samplau rheoli a PPA nag mewn samplau rheoli. Mae dotiau du yn cynrychioli genynnau â niferoedd gwahanol iawn, gyda gwahaniaethau CLR cymedrig rhwng -1 ac 1. Cyfrifwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf U Mann-Whitney a'u cywiro ar gyfer cymhariaethau lluosog gan ddefnyddio'r weithdrefn Benjamini-Hochberg. Mae genynnau'n cyfateb i enynnau cynrychioliadol yn y catalog genynnau nad ydynt yn ddiangen. Mae enwau genynnau'n cynnwys y symbol KEGG sy'n dynodi genyn KO. Mae gwahaniaethau CLR cymedrig trwm yn dynodi niferoedd gwahanol iawn. Mae llinell doriad (-) yn dangos nad oes symbol ar gyfer y genyn yn gronfa ddata KEGG.
Nodwyd tacsa gyda genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd a/neu gynhyrchu PPA trwy baru hunaniaeth tacsonomegol y contigs ag ID contig y genyn. Ar lefel y genws, canfuwyd bod gan 130 o genera enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA a chanfuwyd bod gan 61 o genera enynnau sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA (Tabl Atodol 4). Fodd bynnag, ni ddangosodd unrhyw genera wahaniaethau sylweddol o ran nifer (p > 0.05).
Ar lefel y rhywogaeth, canfuwyd bod gan 144 o rywogaethau bacteriol enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA a chanfuwyd bod gan 68 o rywogaethau bacteriol enynnau sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA (Tabl Atodol 5). Ymhlith y metabolyddion PPA, dangosodd wyth bacteria gynnydd sylweddol mewn helaethrwydd rhwng mathau o samplau, a dangosodd pob un newidiadau sylweddol mewn effaith (Tabl Atodol 6). Roedd yr holl fetabolyddion PPA a nodwyd gyda gwahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd yn fwy niferus mewn samplau PPA. Datgelodd dosbarthiad ar lefel rhywogaeth gynrychiolwyr o genera nad oeddent yn wahanol yn sylweddol rhwng mathau o samplau, gan gynnwys sawl rhywogaeth o Bacteroides a Ruminococcus, yn ogystal â Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, ac Alcaligenes polymorpha. Ymhlith y bacteria sy'n cynhyrchu PPA, dangosodd pedwar bacteria wahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd rhwng mathau o samplau. Roedd rhywogaethau gyda gwahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd yn cynnwys Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, a Ruminococcus bovis.
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom archwilio effeithiau dod i gysylltiad â PPA ar ficrobiota perfedd llygod. Gall PPA ysgogi ymatebion gwahanol mewn bacteria oherwydd ei fod yn cael ei gynhyrchu gan rai rhywogaethau, ei ddefnyddio fel ffynhonnell fwyd gan rywogaethau eraill, neu fod ganddo effeithiau gwrthficrobaidd. Felly, gall ei ychwanegu at amgylchedd y perfedd trwy atchwanegiadau dietegol gael effeithiau gwahanol yn dibynnu ar oddefgarwch, tueddiad, a'r gallu i'w ddefnyddio fel ffynhonnell maetholion. Gall rhywogaethau bacteriol sensitif gael eu dileu a'u disodli gan y rhai sy'n fwy gwrthsefyll PPA neu sy'n gallu ei ddefnyddio fel ffynhonnell fwyd, gan arwain at newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd. Datgelodd ein canlyniadau wahaniaethau sylweddol yng nghyfansoddiad microbaidd ond dim effaith ar amrywiaeth microbaidd gyffredinol. Gwelwyd yr effeithiau mwyaf ar lefel y rhywogaeth, gyda dros 70 o dacsonau yn sylweddol wahanol o ran nifer rhwng samplau PPA a samplau rheoli (Tabl Atodol 2). Datgelodd gwerthusiad pellach o gyfansoddiad samplau a ddaeth i gysylltiad â PPA fwy o amrywioldeb rhywogaethau microbaidd o'i gymharu â samplau heb eu dod i gysylltiad â nhw, gan awgrymu y gallai PPA wella nodweddion twf bacteriol a chyfyngu ar boblogaethau bacteriol a all oroesi mewn amgylcheddau cyfoethog o PPA. Felly, gall PPA ysgogi newidiadau yn ddetholus yn hytrach nag achosi aflonyddwch eang ar amrywiaeth microbiota'r perfedd.
Dangoswyd yn flaenorol fod cadwolion bwyd fel PPA yn newid helaethrwydd cydrannau microbiom y perfedd heb effeithio ar amrywiaeth gyffredinol (Nagpal et al., 2021). Yma, gwelsom y gwahaniaethau mwyaf trawiadol rhwng rhywogaethau Bacteroidetes o fewn y ffylwm Bacteroidetes (a elwid gynt yn Bacteroidetes), a oedd wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA. Mae mwy o helaethrwydd rhywogaethau Bacteroides yn gysylltiedig â mwy o ddiraddio mwcws, a all gynyddu'r risg o haint a hyrwyddo llid (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Canfu un astudiaeth fod llygod gwrywaidd newyddenedigol a gafodd eu trin â Bacteroides fragilis yn arddangos ymddygiadau cymdeithasol sy'n atgoffa rhywun o anhwylder sbectrwm awtistiaeth (ASD) (Carmel et al., 2023), ac mae astudiaethau eraill wedi dangos y gall rhywogaethau Bacteroides newid gweithgaredd imiwnedd ac arwain at gardiomyopathi llidiol hunanimiwn (Gil-Cruz et al., 2019). Roedd rhywogaethau sy'n perthyn i'r genera Ruminococcus, Prevotella, a Parabacteroides hefyd wedi cynyddu'n sylweddol mewn llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA (Coretti et al., 2018). Mae rhai rhywogaethau Ruminococcus yn gysylltiedig â chlefydau fel clefyd Crohn trwy gynhyrchu cytocinau pro-llidiol (Henke et al., 2019), tra bod rhywogaethau Prevotella fel Prevotella humani yn gysylltiedig â chlefydau metabolaidd fel gorbwysedd a sensitifrwydd i inswlin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Yn olaf, gwelsom fod y gymhareb o Bacteroidetes (a elwid gynt yn Firmicutes) i Bacteroidetes yn sylweddol is mewn llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA nag mewn llygod rheoli oherwydd cyfanswm uwch o rywogaethau Bacteroidetes. Dangoswyd yn flaenorol fod y gymhareb hon yn ddangosydd pwysig o homeostasis berfeddol, ac mae aflonyddwch yn y gymhareb hon wedi'i gysylltu â gwahanol gyflyrau clefyd (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), gan gynnwys clefydau llidiol y coluddyn (Stojanov et al., 2020). Gyda'i gilydd, ymddengys mai rhywogaethau o'r ffylwm Bacteroidetes sy'n cael eu heffeithio gryfaf gan PPA dietegol uwch. Gall hyn fod oherwydd goddefgarwch uwch i PPA neu'r gallu i ddefnyddio PPA fel ffynhonnell ynni, sydd wedi'i ddangos i fod yn wir am o leiaf un rhywogaeth, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Fel arall, gall amlygiad mamol i PPA wella datblygiad ffetws trwy wneud perfedd epil llygoden yn fwy agored i wladychu Bacteroidetes; fodd bynnag, nid oedd dyluniad ein hastudiaeth yn caniatáu asesiad o'r fath.
Datgelodd asesiad cynnwys metagenomig wahaniaethau sylweddol yn nifer y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd a chynhyrchu PPA, gyda llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA yn arddangos nifer uwch o enynnau sy'n gyfrifol am gynhyrchu PPA, tra bod llygod nad oeddent wedi'u hamlygu i PPA yn arddangos nifer uwch o enynnau sy'n gyfrifol am fetaboledd PAA (Ffigur 6). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu nad yw effaith PPA ar gyfansoddiad microbaidd o bosibl oherwydd ei ddefnydd yn unig, fel arall dylai nifer y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA fod wedi dangos nifer uwch ym microbiom perfedd llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA. Un esboniad yw bod PPA yn cyfryngu nifer y bacteria yn bennaf trwy ei effeithiau gwrthficrobaidd yn hytrach na thrwy ei ddefnydd gan facteria fel maetholyn. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod PPA yn atal twf Salmonella Typhimurium mewn modd sy'n ddibynnol ar ddos ​​(Jacobson et al., 2018). Gall dod i gysylltiad â chrynodiadau uwch o PPA ddethol bacteria sy'n gwrthsefyll ei briodweddau gwrthficrobaidd ac efallai na fyddant o reidrwydd yn gallu ei fetaboli na'i gynhyrchu. Er enghraifft, dangosodd sawl rhywogaeth o Parabacteroides nifer sylweddol uwch mewn samplau PPA, ond ni chanfuwyd unrhyw enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd neu gynhyrchu PPA (Tablau Atodol 2, 4, a 5). Ar ben hynny, mae cynhyrchu PPA fel sgil-gynnyrch eplesu wedi'i ddosbarthu'n eang ymhlith amrywiol facteria (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Gall amrywiaeth bacteriol uwch fod y rheswm dros y nifer uwch o enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA mewn samplau rheoli (Averina et al., 2020). Ar ben hynny, dim ond 27 (2.14%) o 1332 o enynnau a ragwelwyd i fod yn enynnau sy'n gysylltiedig yn gyfan gwbl â metaboledd PPA. Mae llawer o enynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA hefyd yn gysylltiedig â llwybrau metabolaidd eraill. Mae hyn ymhellach yn dangos bod nifer y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA yn uwch yn y samplau rheoli; gall y genynnau hyn weithredu mewn llwybrau nad ydynt yn arwain at ddefnyddio neu ffurfio PPA fel sgil-gynnyrch. Yn yr achos hwn, dim ond un genyn sy'n gysylltiedig â chynhyrchu PPA a ddangosodd wahaniaethau sylweddol mewn nifer rhwng mathau o samplau. Mewn cyferbyniad â genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA, dewiswyd genynnau marciwr ar gyfer cynhyrchu PPA oherwydd eu bod yn gysylltiedig yn uniongyrchol â'r llwybr bacteriol ar gyfer cynhyrchu PPA. Mewn llygod a oedd wedi dod i gysylltiad â PPA, canfuwyd bod gan bob rhywogaeth gynnydd sylweddol yn eu niferoedd a'u gallu i gynhyrchu PPA. Mae hyn yn cefnogi'r rhagfynegiad y byddai PPAs yn dewis cynhyrchwyr PPA ac felly'n rhagweld y byddai capasiti cynhyrchu PPA yn cynyddu. Fodd bynnag, nid yw niferoedd genynnau o reidrwydd yn cydberthyn â mynegiant genynnau; felly, er bod nifer y genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd PPA yn uwch mewn samplau rheoli, gall y gyfradd mynegiant fod yn wahanol (Shi et al., 2014). I gadarnhau'r berthynas rhwng nifer yr achosion o enynnau sy'n cynhyrchu PPA a chynhyrchu PPA, mae angen astudiaethau o fynegiant genynnau sy'n ymwneud â chynhyrchu PPA.
Datgelodd anodiad swyddogaethol y metagenomau PPA a rheoli rai gwahaniaethau. Datgelodd dadansoddiad PCA o gynnwys genynnau glystyrau arwahanol rhwng samplau PPA a rheoli (Ffigur 5). Datgelodd clystyru o fewn y sampl fod cynnwys y genynnau rheoli yn fwy amrywiol, tra bod samplau PPA wedi clystyru gyda'i gilydd. Roedd clystyru yn ôl cynnwys genynnau yn gymharol â chlystyru yn ôl cyfansoddiad rhywogaethau. Felly, mae gwahaniaethau yn nifer y llwybrau yn gyson â newidiadau yn nifer y rhywogaethau a'r straeniau penodol ynddynt. Mewn samplau PPA, roedd dau lwybr â nifer sylweddol uwch yn gysylltiedig â metaboledd siwgr aminosiwgr/niwcleotid (ko:K21279) a llwybrau metaboledd lipid lluosog (ko:K00647, ko:K03801; Tabl Atodol 3). Gwyddys bod genynnau sy'n gysylltiedig â ko:K21279 yn gysylltiedig â'r genws Bacteroides, un o'r genera â nifer sylweddol uwch o rywogaethau yn y samplau PPA. Gall yr ensym hwn osgoi'r ymateb imiwnedd trwy fynegi polysacaridau capsiwlaidd (Wang et al., 2008). Gall hyn gyfrif am y cynnydd mewn Bacteroidetes a welwyd mewn llygod a oedd wedi'u hamlygu i PPA. Mae hyn yn ategu'r synthesis asid brasterog cynyddol a welwyd ym microbiom PPA. Mae bacteria'n defnyddio'r llwybr FASIIko:K00647 (fabB) i gynhyrchu asidau brasterog, a all ddylanwadu ar lwybrau metabolaidd y gwesteiwr (Yao a Rock, 2015; Johnson et al., 2020), a gall newidiadau mewn metaboledd lipid chwarae rhan mewn niwroddatblygiad (Yu et al., 2020). Llwybr arall sy'n dangos mwy o helaethrwydd mewn samplau PPA oedd biosynthesis hormonau steroid (ko:K12343). Mae tystiolaeth gynyddol bod perthynas wrthdro rhwng gallu microbiota'r perfedd i ddylanwadu ar lefelau hormonau a chael ei ddylanwadu gan hormonau, fel y gall lefelau steroid uchel gael canlyniadau iechyd i lawr yr afon (Tetel et al., 2018).
Nid yw'r astudiaeth hon heb gyfyngiadau ac ystyriaethau. Gwahaniaeth pwysig yw na wnaethom gynnal asesiadau ffisiolegol o'r anifeiliaid. Felly, nid yw'n bosibl dod i gasgliad uniongyrchol a yw newidiadau yn y microbiom yn gysylltiedig ag unrhyw glefyd. Ystyriaeth arall yw bod y llygod yn yr astudiaeth hon wedi cael yr un diet â'u mamau. Gall astudiaethau yn y dyfodol benderfynu a yw newid o ddeiet cyfoethog mewn PPA i ddeiet heb PPA yn gwella ei effeithiau ar y microbiom. Un cyfyngiad ar ein hastudiaeth ni, fel llawer o rai eraill, yw maint cyfyngedig y sampl. Er y gellir tynnu casgliadau dilys, byddai maint sampl mwy yn darparu mwy o bŵer ystadegol wrth ddadansoddi'r canlyniadau. Rydym hefyd yn ofalus ynghylch tynnu casgliadau am gysylltiad rhwng newidiadau yn y microbiom perfedd ac unrhyw glefyd (Yap et al., 2021). Gall ffactorau dryslyd gan gynnwys oedran, rhyw, a diet ddylanwadu'n sylweddol ar gyfansoddiad micro-organebau. Gall y ffactorau hyn esbonio'r anghysondebau a welwyd yn y llenyddiaeth ynghylch cysylltiad y microbiom perfedd â chlefydau cymhleth (Johnson et al., 2019; Lagod a Naser, 2023). Er enghraifft, dangoswyd bod aelodau o'r genws Bacteroidetes naill ai wedi cynyddu neu wedi lleihau mewn anifeiliaid a bodau dynol ag ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Yn yr un modd, mae astudiaethau o gyfansoddiad y coluddyn mewn cleifion â chlefydau llidiol y coluddyn wedi canfod cynnydd a gostyngiad yn yr un tacsa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Er mwyn cyfyngu ar effaith rhagfarn rhywedd, fe geisiom sicrhau cynrychiolaeth gyfartal o'r rhywiau fel bod y gwahaniaethau yn fwyaf tebygol o gael eu gyrru gan ddeiet. Un her i anodi swyddogaethol yw cael gwared ar ddilyniannau genynnau diangen. Mae ein dull clystyru genynnau yn gofyn am 95% o hunaniaeth dilyniant ac 85% o debygrwydd hyd, yn ogystal â 90% o orchudd aliniad i ddileu clystyru ffug. Fodd bynnag, mewn rhai achosion, gwelsom COGs gyda'r un anodiadau (e.e., MUT) (Ffig. 6). Mae angen astudiaethau pellach i benderfynu a yw'r orthologau hyn yn wahanol, yn gysylltiedig â genera penodol, neu a yw hyn yn gyfyngiad ar y dull clwstrio genynnau. Cyfyngiad arall ar anodiad swyddogaethol yw camddosbarthu posibl; mae'r genyn bacteriol mmdA yn ensym hysbys sy'n ymwneud â synthesis propionad, ond nid yw KEGG yn ei gysylltu â'r llwybr metabolaidd propionad. Mewn cyferbyniad, mae'r orthologau scpB a mmcD yn gysylltiedig. Gall y nifer fawr o enynnau heb ergydion dynodedig arwain at anallu i nodi genynnau sy'n gysylltiedig â PPA wrth asesu helaethrwydd genynnau. Bydd astudiaethau yn y dyfodol yn elwa o ddadansoddiad metatranscriptome, a all ddarparu dealltwriaeth ddyfnach o nodweddion swyddogaethol y microbiota perfedd a chysylltu mynegiant genynnau ag effeithiau posibl i lawr yr afon. Ar gyfer astudiaethau sy'n cynnwys anhwylderau niwroddatblygiadol penodol neu glefydau llidiol y coluddyn, mae angen asesiadau ffisiolegol ac ymddygiadol o anifeiliaid i gysylltu newidiadau yng nghyfansoddiad y microbiom â'r anhwylderau hyn. Byddai astudiaethau ychwanegol yn trawsblannu'r microbiom perfedd i lygod di-germau hefyd yn ddefnyddiol i benderfynu a yw'r microbiom yn sbardun neu'n nodwedd o glefyd.
I grynhoi, dangoson ni fod PPA dietegol yn gweithredu fel ffactor wrth newid cyfansoddiad microbiota'r perfedd. Mae PPA yn gadwolyn a gymeradwywyd gan yr FDA a geir yn helaeth mewn amrywiol fwydydd a all, ar ôl dod i gysylltiad ag ef yn y tymor hir, arwain at amharu ar fflora arferol y perfedd. Gwelsom newidiadau yn nifer y bacteria sy'n awgrymu y gall PPA ddylanwadu ar gyfansoddiad microbiota'r perfedd. Gall newidiadau yn y microbiota arwain at newidiadau yn lefelau llwybrau metabolaidd penodol, a all arwain at newidiadau ffisiolegol sy'n berthnasol i iechyd y gwesteiwr. Mae angen astudiaethau pellach i benderfynu a all effeithiau PPA dietegol ar gyfansoddiad microbaidd arwain at dysbiosis neu glefydau eraill. Mae'r astudiaeth hon yn gosod y sylfaen ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol ar sut y gall effeithiau PPA ar gyfansoddiad y perfedd effeithio ar iechyd pobl.
Mae'r setiau data a gyflwynir yn yr astudiaeth hon ar gael mewn ystorfeydd ar-lein. Enw'r ystorfa a'r rhif mynediad yw: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Cymeradwywyd yr astudiaeth anifeiliaid hon gan Bwyllgor Gofal a Defnyddio Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Canol Florida (UCF-IACUC) (Rhif Trwydded Defnyddio Anifeiliaid: PROTO202000002). Mae'r astudiaeth hon yn cydymffurfio â chyfreithiau, rheoliadau a gofynion sefydliadol lleol.
NG: Cysyniadoli, Curadu data, Dadansoddi ffurfiol, Ymchwiliad, Methodoleg, Meddalwedd, Delweddu, Ysgrifennu (drafft gwreiddiol), Ysgrifennu (adolygu a golygu). LA: Cysyniadoli, Curadu data, Methodoleg, Adnoddau, Ysgrifennu (adolygu a golygu). SH: Dadansoddi ffurfiol, Meddalwedd, Ysgrifennu (adolygu a golygu). SA: Ymchwiliad, Ysgrifennu (adolygu a golygu). Prif Farnwr: Ymchwiliad, Ysgrifennu (adolygu a golygu). SN: Cysyniadoli, Gweinyddu prosiectau, Adnoddau, Goruchwylio, Ysgrifennu (adolygu a golygu). TA: Cysyniadoli, Gweinyddu prosiectau, Goruchwylio, Ysgrifennu (adolygu a golygu).
Datganodd yr awduron nad oeddent wedi derbyn unrhyw gefnogaeth ariannol ar gyfer ymchwil, awduraeth, a/neu gyhoeddi'r erthygl hon.
Mae'r awduron yn datgan bod yr ymchwil wedi'i chynnal yn absenoldeb unrhyw berthnasoedd masnachol neu ariannol y gellid eu dehongli fel gwrthdaro buddiannau posibl. Ddim yn berthnasol.
Barn yr awduron yn unig yw'r holl farnau a fynegir yn yr erthygl hon ac nid ydynt o reidrwydd yn adlewyrchu barn eu sefydliadau, cyhoeddwyr, golygyddion na hadolygwyr. Nid yw unrhyw gynhyrchion a werthusir yn yr erthygl hon, nac unrhyw honiadau a wneir gan eu gweithgynhyrchwyr, wedi'u gwarantu na'u cymeradwyo gan y cyhoeddwr.
Mae deunydd atodol ar gyfer yr erthygl hon ar gael ar-lein: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Mae asid propionig yn achosi gliosis a niwro-llid trwy reoleiddio llwybr PTEN/AKT mewn anhwylderau sbectrwm awtistiaeth. Adroddiadau gwyddonol 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Dadansoddiad ystadegol o ddata cyfansoddiadol. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Cymhareb Firmicutes/Bacteroidetes fel ffactor risg ar gyfer canser y fron. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol o ddata cyfrif dilyniant. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, ac eraill (2013). Microbiota fecal a'r metabolom mewn plant ag awtistiaeth ac anhwylder datblygiadol treiddiol nad yw wedi'i nodi fel arall. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Nodweddion niwrometabolaidd bacteriol y microbiota berfeddol mewn plant ifanc ag anhwylderau sbectrwm awtistiaeth. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Y microbiom fel organ ddynol. Microbioleg Glinigol a Heintiau 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Mewnwelediadau newydd i ffisioleg bacteria sy'n cynhyrchu asid propionig: Anaerotignum propionicum ac Anaerotignum neopropionicum (Clostridium propionicum a Clostridium neopropionicum gynt). Micro-organebau 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Maeth mamau a datblygiad y ffetws. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., a Hochberg, J. (1995). Rheoli'r gyfradd positif-ffug: Dull ymarferol ac effeithlon o brofion lluosog. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x