Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Yn wahanol i fertebratau, credir yn eang nad oes gan bryfed hormonau steroid rhyw sy'n dueddol o fod yn wrywod.Yn Anopheles gambiae, ymddengys bod y steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) wedi esblygu i reoli datblygiad wyau pan gânt eu syntheseiddio gan fenywod2 ac i ysgogi cyfnod anhydrin paru pan gânt eu trosglwyddo'n rhywiol gan wrywod3.Gan fod datblygiad wyau a pharu yn nodweddion atgenhedlu hanfodol, gallai deall sut mae mosgitos Anopheles benywaidd yn integreiddio'r signalau hormonaidd hyn hwyluso dylunio rhaglenni rheoli malaria newydd.Yma, rydym yn datgelu bod y swyddogaethau atgenhedlu hyn yn cael eu rheoleiddio gan steroidau rhyw gwahanol trwy rwydwaith cymhleth o ensymau sy'n actifadu/anactifadu ecdysteroid.Nodom ecdysone ocsidiedig penodol i wrywod, 3-dehydro-20E (3D20E), sy'n amddiffyn rhiant trwy gau derbynioldeb rhywiol benywaidd yn dilyn trosglwyddo rhywiol ac actifadu trwy ddadffosfforyleiddio.Yn nodedig, fe wnaeth trosglwyddo 3D20E hefyd ysgogi mynegiant genynnau atgenhedlu sy'n cynnal datblygiad wyau yn ystod haint Plasmodium, gan sicrhau iechyd benywod heintiedig.Nid yw 20E sy'n deillio o fenywod yn ennyn ymateb rhywiol, ond mae'n caniatáu i unigolion sy'n paru ddodwy wyau ar ôl i ginasau sy'n atal 20E gael eu hatal. Mae adnabod yr hormon steroid pryfyn penodol hwn sy'n benodol i wrywiaid a'i rôl wrth reoleiddio derbynioldeb rhywiol benywaidd, ffrwythlondeb a rhyngweithio â Plasmodium yn awgrymu'r potensial i leihau llwyddiant atgenhedlu mosgitos sy'n trosglwyddo malaria.
Mae achosion a marwolaethau malaria ar gynnydd eto4 oherwydd ymwrthedd eang i bryfleiddiaid mewn mosgitos Anopheles, yr unig fector sy'n cludo parasitiaid malaria dynol. Mae bioleg paru'r mosgitos hyn yn darged arbennig o ddeniadol ar gyfer ymyriadau rheoli malaria newydd oherwydd dim ond unwaith y mae benywod yn paru5; byddai gwneud y digwyddiad paru sengl hwn yn ddi-haint â photensial mawr i leihau poblogaethau mosgitos yn y maes.
Mae menywod yn dod yn analluog yn rhywiol ar ôl derbyn hormonau steroid titer uchel gan ddynion. Mae astudiaethau wedi dangos mai'r sbardun ar gyfer anhawster mewn paru pellach yw 20-hydroxyecdysone (20E), hormon steroid sy'n fwy adnabyddus fel rheolydd y cylch moltio yn y cyfnod larfa. Mae gallu gwrywod i syntheseiddio a throsglwyddo 20E wedi esblygu'n benodol mewn rhywogaethau Anopheles sy'n rhan o'r is-genws Cellia7, sydd wedi'i ddosbarthu yn Affrica ac yn cynnwys y cludwyr malaria mwyaf peryglus, gan gynnwys Anopheles gambiae. Mae hyn yn arbennig o nodedig oherwydd yn y rhywogaethau hyn mae benywod hefyd yn cynhyrchu 20E ar ôl pob pryd gwaed, ac mae 20E yn gyrru'r cylch oogenesis (gweler cyf. 8). Fodd bynnag, ychydig a wyddys am y ffordd y mae benywod yn integreiddio signalau o ddau ffynhonnell wahanol o ecdysone (trosglwyddo gwrywaidd ac ysgogi bwydo gwaed) heb beryglu eu gallu eu hunain i baru. Mewn gwirionedd, os yw'r 20E a gynhyrchir gan y benywod yn sbarduno anoddefiad rhywiol, bydd hyn yn arwain at anffrwythlondeb mewn unigolion sy'n bwydo ar wyryf, ymddygiad cyffredin iawn yn y mosgitos hyn5.
Esboniad posibl yw bod gwrywod A. gambiae yn trosglwyddo ecdysone penodol i'r gwryw wedi'i addasu, sy'n actifadu rhaeadr signalau yn y llwybr atgenhedlu benywaidd, gan arwain at ansefydlogrwydd paru. Fodd bynnag, er bod gan fertebratau hormonau steroid lluosog, fel estrogen ac androgen (adolygwyd yng nghyf. 9), hyd y gwyddom ni, nid yw steroidau â thuedd androgenig wedi'u nodi mewn pryfed.
Fe wnaethon ni geisio pennu repertoire yr hormonau steroid yn y chwarren ategol gwrywaidd (MAG) o A. gambiae aeddfed yn rhywiol wrth chwilio am steroidau addasol posibl. Gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uchel ynghyd â sbectrometreg màs tandem (HPLC-MS/MS) yn hytrach na'r dull llai penodol a ddefnyddiwyd yn flaenorol, fe wnaethon ni ganfod ecdysone (E) a 20E yn y meinwe hon, gan gadarnhau'r canlyniad blaenorol. Fodd bynnag, roedd y sampl yn cael ei dominyddu gan steroidau ffosfforyleiddiedig ocsidiedig, yn gyson â'r fformiwla 3-dehydro-20E-22-ffosffad (3D20E22P)12 (Ffigur 1). Mae ffurfiau eraill yn cynnwys 3-dehydro-20E (3D20E) a 20E-22-ffosffad (20E22P). Roedd dwyster signal HPLC-MS/MS 3D20E22P ddwy orchymyn maint yn uwch na'i ffurf ddadffosfforyleiddiedig, 3D20E, a thri orchymyn maint yn uwch na dwyster E a 20E (Ffigur 1). Er mewn rhannau eraill o'r corff a'r llwybr atgenhedlu isaf (LRT; Data Estynedig Ffig. 1a). Fe wnaethom hefyd ddadansoddi ecdysteroidau mewn gwrywod a benywod newydd eu cau (<1 diwrnod oed) a chanfod 3D20E a 3D20E22P yn MAG yn unig; roedd E, 20E a 20E22P yn bresennol yn y ddau ryw (Data Estynedig Ffig. 1b). Mae'r data hyn yn awgrymu bod gwrywod oedolion A. gambiae yn cynhyrchu titrau uchel o hormonau addasu yn eu MAGs nad ydynt yn cael eu syntheseiddio gan fenywod.
Dyrannwyd MAG ac LRT benywaidd (gan gynnwys atria, fesiglau seminaidd, a pharovarium) o wrywod gwyryfon 4 diwrnod oed (4 diwrnod oed) a benywod gwyryfon a benywod wedi paru (0.5, 3, a 12 hpm). Dadansoddwyd Ecdysone yn y meinweoedd hyn gan HPLC-MS/MS (cymedr ± sem; prawf-t heb ei baru, dwy ochr, cyfradd darganfod ffug (FDR) wedi'i chywiro; NS, ddim yn arwyddocaol; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 awr vs. 0.5 awr, P = 0.035; 12 awr vs. 3 awr, P = 0.0015; 12 awr vs. 0.5 awr, P = 0.030. 3D20E22P: 3 awr vs. 0.5 awr, P = 0.25; 12 awr vs. 3 awr, P = 0.0032; 12 awr vs. 0.5 awr, P = 0.015). Daw'r data o dri dyblygiad biolegol. Cyfrifwyd arwynebedd brig pob ecdysone o ddiddordeb a'i normaleiddio yn ôl nifer y mosgitos. Cynrychiolir ecdysone gan liw fel a ganlyn: E, gwyrdd; 20E, oren; 20E22P, porffor; 3D20E, glas; 3D20E22P, pinc. Mae'r mewnosodiad yn cynyddu'r raddfa ar yr echelin-y i ddangos lefelau ecdysone is.
Er mwyn ymchwilio i weld a yw 3D20E22P a 3D20E yn cael eu trosglwyddo yn ystod paru, fe wnaethom ddyrannu LRTs benywaidd ar wahanol adegau ar ôl paru. Er na chanfuwyd ecdysone mewn morynion, gwelsom symiau sylweddol o 3D20E22P yn yr LRT yn syth ar ôl paru (0.5 awr ar ôl paru, hpm), gan leihau dros amser, tra bod lefelau 3D20E wedi cynyddu'n sylweddol (Ffig. 1). Gan ddefnyddio 3D20E wedi'i syntheseiddio'n gemegol fel safon, fe benderfynom fod lefelau'r hormon steroid hwn mewn LRTs paru o leiaf 100 gwaith yn uwch na 20E (Tabl Data Estynedig 1). Felly, 3D20E22P yw'r prif ecdysone gwrywaidd sy'n cael ei drosglwyddo i'r LRT benywaidd yn ystod paru, ac mae ei ffurf ddadffosfforyleiddiedig, 3D20E, yn dod yn doreithiog iawn yn fuan ar ôl paru. Mae hyn yn awgrymu rôl bwysig i'r ecdysone olaf mewn bioleg ôl-baru benywaidd.
Ar ôl cynhyrchu set ddata dilyniannu RNA newydd (RNA-seq) (Ffig. 2a), gan ddefnyddio piblinell biowybodeg wedi'i hadeiladu'n bwrpasol, fe wnaethom chwilio am ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ac ecdysone sy'n amgodio'r genyn ffosffatase wedi'i addasu ag 20E. Mynegir EPP) mewn meinweoedd atgenhedlu. Fe wnaethom nodi un genyn EPP ymgeisydd a dau enyn EcK posibl (EcK1 ac EcK2), ond ni allem ddod o hyd i enyn EO ymgeisydd da. Yn nodedig, mynegwyd genynnau EPP unigol ar lefelau uchel (98.9fed ganradd) mewn MAGs Gambia ond nid mewn LRTs benywaidd (Ffig. 2b), yn groes i'n disgwyliadau gan fod dadffosfforyleiddiad 3D20E22P wedi digwydd yn y meinwe fenywaidd hon. Felly, credwn y gellir trosglwyddo EPP gwrywaidd yn ystod paru. Yn wir, fe wnaethom ddefnyddio labelu isotop sefydlog in vivo i guddio'r protein benywaidd ar ôl paru, ensym a nodwyd gan MS yn atriwm y fenyw (Ffig. 2c a Thabl Atodol 1). Presenoldeb Cadarnhawyd EPP mewn MAG ac LRT benywaidd wedi paru (ond nid gwyryf) gan ddefnyddio gwrthgyrff penodol hefyd (Ffig. 2d).
a, Piblinell biowybodeg wedi'i hadeiladu'n bwrpasol i chwilio meinweoedd atgenhedlu pob rhyw am enynnau sy'n amgodio EcKs, EOs, ac EPPs. Mae'r rhifau wrth ymyl y saethau yn dangos nifer yr ymgeiswyr gwrywaidd a benywaidd ym mhob cam. Nododd y dadansoddiad hwn un genyn EPP (EPP) ac un genyn EcK (EcK1) sy'n cael eu mynegi mewn gwrywod, ac un genyn EcK (EcK2) sy'n cael ei fynegi yn y ddau ryw ond nad yw'n cynhyrchu genyn EO ymgeisydd. b, Map Gwres yn cymharu mynegiant genynnau ymgeisydd mewn meinweoedd Anopheles gambiae ac Anopheles albicans gwyryfol (V) a pharu (M). Spca, ffrwythloni; MAGs, chwarennau ategol mewn gwrywod; rhannau eraill o'r corff, gan gynnwys bronnau, adenydd, coesau, cyrff brasterog, ac organau mewnol yn y ddau ryw, ac ofarïau mewn menywod. Mae EcK2 yn cael ei fynegi'n uchel yn MAG ac atria Gambia, tra mai dim ond yn MAG y ceir EPP.c, Dadansoddiad proteomig o drawsleoliad grŵp alldaflu gwrywaidd i atria benywaidd ar 3, 12 a 24 hpm, gan ddangos y 67 protein mwyaf niferus. Magwyd menywod ar ddeiet yn cynnwys 15N i labelu (a chuddio) yr holl broteinau. Parwyd gwrywod heb eu tagio â benywod wedi'u tagio, a dyrannwyd LRTs benywaidd ar 3, 12 a 24 hpm ar gyfer dadansoddiad proteomig (gweler Tabl Atodol 1 am restr gyflawn o broteinau alldaflu). Mewnosodiad, canfuwyd EPP, Eck1 ac EcK2 yn MAG gwrywod gwyryf trwy ddadansoddiad proteomig o'r meinweoedd hyn.d, Canfuwyd EPP trwy blot gorllewinol yn MAG ac LRT benywod wedi'u paru, ond nid mewn menywod na gwrywod gwyryf na gweddill corff y fenyw. Cafodd pilenni eu haddasu ar yr un pryd wedi'i brofi gyda gwrthgyrff gwrth-actin (rheolaeth llwytho) a gwrthgyrff gwrth-EPP. Mae pob gwryw yn wyryfon. Gweler Ffigur Atodol 1 am ddata ffynhonnell gel. Perfformiwyd blotiau Gorllewinol ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.
Gwiriwyd gweithgaredd ffosffoffosffatase ecdysteroid EPP ar ôl ei ddeori gan HPLC-MS/MS gyda 3D20E22P wedi'i ynysu o MAG (Data Estynedig Ffig. 2a). Ar ben hynny, pan wnaethom dawelu EPP gan ymyrraeth a gyfryngir gan RNA (RNAi), canfuom ostyngiad cryf yng ngweithgaredd ffosffatase ym meinweoedd atgenhedlu'r gwrywod hyn (Ffig. 3a), a dangosodd benywod a barwyd â gwrywod a dawelwyd gan EPP gyfran sylweddol is o 3D20E wedi'i ddadffosforyleiddio (Ffig. 3b) er gwaethaf tawelu genynnau rhannol (Data Estynedig Ffig. 2b,c). Mewn cyferbyniad, ni chanfuom newidiadau sylweddol yn y gymhareb 20E22P/20E yn yr un mosgitos, a allai awgrymu bod yr ensym yn benodol ar gyfer 3D20E22P (Ffig. 3b).
a, Gweithgaredd ffosffatase is mewn MAG a achosir gan dawelu EPP gan ddefnyddio rheolyddion RNA EPP llinyn dwbl (dsEPP) neu RNA GFP llinyn dwbl (dsGFP).Defnyddiwyd ugain o byllau MAG ym mhob dyblygiad (P = 0.0046, prawf-t pâr, dwy ochr), a gynrychiolir gan ddotiau ar wahân.b, Roedd gan fenywod a barwyd â gwrywod a oedd wedi'u tawelu ag EPP gyfran sylweddol is o 3D20E wedi'i ddadffosfforyleiddio ar 3 hpm (P = 0.0043, prawf-t heb ei baru, dwy ochr), tra nad oedd lefelau 20E wedi'u heffeithio (P = 0.063, heb ei baru). prawf-t, dwy ochr). Cyflwynir data fel cymedr ± sem o dair pwll o 13, 16 a 19 o fenywod yr un.c, Roedd gan fenywod a baru â gwrywod wedi'u tawelu gan EPP gyfraddau ail-baru sylweddol uwch (P = 0.0002, prawf union Fisher, dwy ochr). Gorfodwyd y benywod i baru yn gyntaf i sicrhau eu statws paru; 2 ddiwrnod yn ddiweddarach, cysylltwyd â nhw â gwrywod eraill yn cario sberm trawsgenig i asesu cyfraddau ail-baru trwy ganfod PCR meintiol o'r trawsgenyn.d, Roedd gan fenywod a fwydwyd ar waed a barwyd â gwrywod wedi'u tawelu ag EPP ffrwythlondeb sylweddol is (P < 0.0001; prawf Mann-Whitney, dwy ochr) a nifer yr wyau ychydig yn is (P = 0.088, prawf Mann-Whitney, dwy ochr), tra nad effeithiwyd ar y gyfradd silio (P = 0.94, prawf union Fisher, dwy ochr).Ym mhob panel, mae n yn cynrychioli nifer y samplau mosgito sy'n annibynnol yn fiolegol.NS, ddim yn arwyddocaol.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Nesaf, fe wnaethom asesu a yw dadffosfforyleiddiad ecdysone yn bwysig ar gyfer ysgogi ymwrthedd paru mewn benywod. Yn arbennig, ail-baruodd benywod a barwyd â gwrywod wedi'u disbyddu o ran EPP ar amlder llawer uwch (44.9%) na benywod rheoli (10.4%) pan oeddent yn agored i wrywod ychwanegol (trawsgenig) (Ffig. 3c). Gwelsom hefyd ostyngiad sylweddol mewn ffrwythlondeb (Ffig. 3d, chwith) a gostyngiad bach yn nifer yr wyau a ddodwyd gan y benywod hyn (Ffig. 3d, canol), tra na chafodd canran yr wyau a ddodwyd gan fenywod (ymateb arall a ysgogwyd mewn benywod trwy baru)) eu heffeithio (Ffig. 3d, dde). O ystyried y manylder a welwyd o EPP ar gyfer 3D20E22P, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai actifadu 3D20E gan EPP a drosglwyddwyd yn ystod paru chwarae rhan bwysig wrth ddiffodd derbynioldeb benywod i baru pellach, ymddygiad a briodolwyd yn flaenorol i drosglwyddiad rhywiol 20E. Felly, mae'r hormon penodol i wrywiaid hwn hefyd yn effeithio'n gryf ar ffrwythlondeb benywaidd.
Nesaf, fe wnaethom gymharu gweithgareddau 20E a 3D20E mewn arbrofion chwistrellu mewn morynion aeddfed yn rhywiol gan ddefnyddio 3D20E wedi'i syntheseiddio'n gemegol (Ffig. 4a–c) a 20E sydd ar gael yn fasnachol. Gwelsom fod 3D20E yn sylweddol fwy effeithiol na 20E wrth gau sensitifrwydd benywod i baru yn y ddau grynodiad (Ffig. 4d). Yn nodedig, fe wnaeth hanner lefel ffisiolegol 3D20E yn yr LRT (1,066 pg ar ôl pigiad vs. 2,022 pg ar ôl paru) achosi cyfran o fenywod anhydrin a oedd 20 gwaith yn uwch na lefel ffisiolegol 20E (361 pg ar ôl pigiad) 24 awr ar ôl pigiad ar y crynodiad uchaf 18 pg ar ôl paru; Tabl Data Estynedig 1). Mae'r canlyniad hwn yn gyson â'r syniad nad yw trosglwyddo rhywiol 20E yn achosi cyfnodau anhydrin paru, ac mae ymhellach yn tynnu sylw at 3D20E fel ffactor pwysig wrth sicrhau perthynas rhiant-plentyn. Roedd 3D20E hefyd yn sylweddol fwy egnïol na 20E mewn asesiadau dodwy wyau mewn benywod gwyryfon (Ffig. 4e), gan awgrymu bod y gyfradd dodwy wyau arferol a welsom ar ôl tawelu EPP rhannol oherwydd presenoldeb gweithgaredd 3D20E gweddilliol a gynhyrchir o hyd gan ffactorau benywaidd a achosir gan Baru.
(a,b) 3D20E wedi'i syntheseiddio'n gemegol o 20E (a) gyda throsi/effeithlonrwydd uchel iawn (data a gyflwynir fel cymedr ± sem o dri adwaith synthesis annibynnol) (b).c, Mae'r sbectrwm màs (hanner gwaelod) yn cyfateb yn union i ecdysone a geir mewn LRT benywaidd wedi'i baru (hanner uchaf).d, O'i gymharu â 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; prawf union Fisher, dwy ochr) ac ethanol 10% (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; prawf union Fisher, dwy ochr), tra bod 20E yn sylweddol uwch na'r rheolydd dim ond ar ddosau uwch (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; prawf union Fisher, dwy ochr).e, 3D20E Achosodd chwistrelliad gyfraddau silio sylweddol uwch mewn benywod gwyryf na rheolyddion ethanol 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; prawf union Fisher, dwy ochr), tra bod 20E o'i gymharu â rheolyddion Dim ond ar ddosau uwch (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; prawf union Fisher, dwy ochr). Achosodd 3D20E gyfraddau silio sylweddol uwch na 20E ar ddosau uwch (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; prawf union Fisher, dwy ochr). Ym mhob panel, mae n yn cynrychioli nifer y samplau mosgito sy'n annibynnol yn fiolegol. NS, ddim yn arwyddocaol. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Daw'r data o tri atgynhyrchiad.
Mewn astudiaethau blaenorol, fe benderfynon ni fod trosglwyddo rhywiol hormonau steroid yn ysgogi mynegiant MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), genyn atgenhedlu benywaidd sy'n amddiffyn benywod A. gambiae rhag haint P. falciparum. Costau iechyd a achosir gan 13, y parasit malaria dynol mwyaf marwol. O ystyried pwysigrwydd MISO i ffitrwydd atgenhedlu Anopheles mewn ardaloedd lle mae malaria yn endemig, fe benderfynon ni benderfynu pa hormon 3D20E neu 20E sy'n sbarduno mynegiant y genyn hwn. Fe wnaethon ni ganfod, er bod chwistrelliad 20E wedi ysgogi rhai derbynyddion hormon niwclear (HR), fel HR3 a HR4, a thargedau steroid nodweddiadol i lawr yr afon, fel y genynnau yologenig Vg14, 15, 16, yn benodol neu'n fwy grymus, bod MISO wedi'i ysgogi'n gryfach gan 3D20E (Data Estynedig Ffig. 3). Felly, mae'n ymddangos bod trosglwyddo rhywiol yr hormon steroid androgenig hwn yn ysgogi mecanweithiau sy'n amddiffyn menywod rhag y costau a achosir gan haint parasitig. Ar ben hynny, mae 3D20E yn effeithio'n wahanol ar y ddau isoffurf o'r... derbynnydd E EcR, gan ysgogi EcR-A ac atal EcR-B, a sbarduno genynnau eraill sy'n ysgogi paru yn gryfach, gan gynnwys HPX15, sy'n effeithio ar ffrwythlondeb benywaidd. Gallai hyn egluro'r anffrwythlondeb sylweddol a welwyd mewn benywod sydd wedi paru â gwrywod sydd wedi'u tawelu gan EPP (Data Estynedig Ffig. 3). Mae'r data hyn yn awgrymu bodolaeth llwybrau i lawr yr afon sy'n cael eu actifadu'n ffafriol gan ddau hormon ecdysone a allai fod yn sail i swyddogaeth benodol i ryw.
Nesaf, fe wnaethom brofi swyddogaeth y ddau enyn EcK a nodwyd yn ein piblinell biowybodeg. Arweiniodd tawelu EcK1 neu EcK2 at farwolaethau sylweddol mewn gwrywod (Data Estynedig Ffig. 4a), gan awgrymu bod ffosfforyleiddiad ecdysone, ac felly anactifadu, yn bwysig ar gyfer goroesi. Gan fod EcK2 wedi'i fynegi ar lefelau uwch nag EcK1 a'i ganfod mewn MAGs gan broteomeg (Ffig. 2b,c a Thabl Atodol 2), fe wnaethom ddilysu ei weithgaredd ecdysteroid kinase trwy ei ddeori gyda 20E, a arweiniodd at ffosfforyleiddiad 20E22P (Data Estynedig Ffigur 2).4b).Wrth ddefnyddio 3D20E fel swbstrad, ni allem ganfod y cynnyrch ffosfforyleiddiedig 3D20E22P (Data Estynedig Ffig. 4c), gan awgrymu y gallai 20E yn hytrach na 3D20E fod y targed dewisol ar gyfer EcK2.
Yn ôl ein dadansoddiad RNA-seq, roedd EcK2 hefyd wedi'i fynegi'n uchel yn LRT benywod gwyryf, lle cafodd ei ddiffodd ar ôl paru (Ffig. 2b). Cadarnhawyd y data hyn a phenderfynwyd nad oedd mynegiant EcK2 wedi'i effeithio gan fwydo gwaed (Data Estynedig Ffig. 5a). Gan ymestyn ein harbrofion MS cychwynnol, penderfynwyd bod uchafbwynt 20E22P yn gysylltiedig yn agos â uchafbwynt 20E (22-26 awr ar ôl pryd o fwyd gwaed; Data Estynedig Ffig. 5b). Arweiniodd tawelu EcK2 mewn benywod gwyryf at gynnydd 3 gwaith yn y gymhareb gymharol o 20E i 20E22P 26 awr ar ôl pryd o fwyd gwaed (Ffigurau Data Estynedig 2c a 5c), gan gadarnhau bod EcK2 hefyd yn ffosfforyleiddio 20E mewn benywod. Yn nodedig, cynhaliodd gwyryfon wedi'u disbyddu o EcK2 dderbynioldeb rhywiol llawn (Data Estynedig Ffig. 5d,e), gan awgrymu ymhellach nad yw cynhyrchu 20E gan fenywod yn achosi cyfnodau anhydrin paru. Fodd bynnag, roedd gan y benywod hyn lawer o... cyfraddau dodwy wyau uwch o'i gymharu â rheolyddion, gyda mwy na 30% o foryfon yn dodwy wyau (Data Estynedig Ffig. 5f). Os perfformiwyd pigiadau RNA Eck2 llinyn dwbl (dsEcK2) ar ôl bwydo â gwaed, ni ddigwyddodd silio, ac ar y pwynt hwnnw roedd brig 20E oherwydd llyncu gwaed wedi gostwng. Ar y cyfan, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi model y gall 20E a gynhyrchir ar ôl sugno gwaed ysgogi silio, ond dim ond pan fydd y bloc silio (EcK2 ac o bosibl ffactorau eraill) yn cael ei ddiffodd trwy baru. Ni wnaeth pigiadau 20E na 3D20E atal mynegiant EcK2 mewn moryfon (Data Estynedig Ffig. 5g), gan awgrymu bod ffactorau eraill yn cyfryngu ataliad y kinase hwn. Fodd bynnag, nid oedd lefelau 20E ar ôl bwydo â gwaed yn ddigonol i achosi anghysur paru, ond fe'u sbardunwyd yn effeithiol gan titrau uchel o 3D20E a drosglwyddwyd yn rhywiol.
Mae ein canlyniadau'n rhoi cipolwg pwysig ar y mecanweithiau sy'n rheoleiddio llwyddiant atgenhedlu A. gambiae. Mae model wedi dod i'r amlwg lle mae gwrywod wedi esblygu i syntheseiddio titrau uchel o 3D20E, ecdyson wedi'i addasu'n benodol i'r gwryw sy'n sicrhau rhiant trwy ddadsensiteiddio benywod i baru ymhellach. Ar yr un pryd, mae'r cludwyr malaria hyn hefyd wedi esblygu system effeithlon i actifadu 3D20E mewn benywod mewn ymateb i drosglwyddiad rhywiol EPP penodol i'r gwryw. Hyd y gwyddom ni, dyma'r enghraifft gyntaf o system hormonau steroid sy'n cael ei dominyddu gan wrywod a benywod sy'n cyflawni swyddogaeth unigryw a hanfodol mewn pryfed. Mae swyddogaeth ecdyson penodol i wrywod wedi'i rhagdybio ond heb ei dangos yn bendant. Er enghraifft, rhagdybiaeth sydd wedi'i gwrthbrofi'n helaeth 18 yw y gall y swyddogaethau hyn gael eu cyflawni gan y rhagflaenydd 20E E1. Mae'n hysbys bod monandry yn Drosophila yn cael ei sbarduno gan drosglwyddiad rhywiol peptidau rhyw bach 19,20 sy'n rhyngweithio â niwronau sy'n nerfu'r llwybr atgenhedlu benywaidd trwy dderbynyddion peptid rhyw penodol 21,22. Mae angen gwaith pellach i bennu'r signalau i lawr yr afon. rhaeadrau a reolir gan 3D20E mewn benywod A. gambiae ac i benderfynu a ellir cadw'r rhaeadrau hyn rhwng mosgitos a Drosophila.
O ystyried rôl bwysig 3D20E ar ffrwythlondeb ac ymddygiad benywaidd a nodwyd yn ein hastudiaeth, mae'r llwybrau sy'n arwain at synthesis ac actifadu 3D20E yn cynnig cyfleoedd newydd ar gyfer strategaethau rheoli mosgitos yn y dyfodol, megis cynhyrchu gwrywod di-haint cystadleuol mewn strategaethau technoleg pryfed di-haint. Defnyddio ar gyfer rhyddhau gwyllt neu i efelychu'r 3D20E mewn chwarae gwyryfol. Efallai bod swyddogaeth benodol i wrywod 3D20E wedi esblygu pan gafodd A. gambiae a rhywogaethau Cellia eraill y gallu i geulo eu semen yn blygiau paru, gan fod hyn yn caniatáu trosglwyddo nifer fawr o hormonau ac ensymau sy'n actifadu hormonau yn effeithlon. Yn ei dro, mae esblygiad 3D20E sy'n gweithredu monandry yn darparu mecanwaith i fenywod (trwy fynegiant uchel o MISO) ffafrio eu ffitrwydd atgenhedlu mewn ardaloedd o gyffredinolrwydd malaria uchel, sy'n cyfrannu'n anuniongyrchol at drosglwyddo Plasmodium. O ystyried bod 20E benywaidd wedi'i ddangos i gael effeithiau dwys ar oroesiad a thwf P. falciparum mewn mosgitos Anopheles benywaidd,24 mae llwybrau hormonau steroid gwrywaidd a benywaidd bellach yn agweddau allweddol ar ryngweithiadau mosgito-parasit.
Magwyd straeniau G3 o A. gambiae o dan amodau pryfed safonol (26-28 °C, lleithder cymharol 65-80%, ffotogyfnod golau/tywyllwch 12:12 awr). Bwydwyd y larfae â bwyd pysgod powdr (Naddion Trofannol TetraMin, Pelenni Koi a Ffonau Pwll Tetra mewn cymhareb o 7:7:2). Bwydwyd mosgitos oedolion ad libitum â thoddiant dextros 10% a gwaed dynol wythnosol (astudiaeth cydrannau gwaed). Cafwyd mosgitos gwyryf trwy wahanu'r rhywiau yng nghyfnod y chwilerod ar ôl archwilio'r pennau trwy ficrosgopeg. Disgrifiwyd gwrywod sy'n cario'r trawsgen DsRed o'r blaen.
Perfformiwyd arbrofion paru gorfodol yn unol â phrotocolau a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Ar gyfer paru naturiol, cadwyd benywod gwyryfon 4 diwrnod oed mewn cymhareb o 1:3 gyda gwrywod gwyryfon aeddfed yn rhywiol am ddwy noson. Ar gyfer arbrofion lle chwistrellwyd gwrywod â dsEPP, roedd y cyd-gawellu yn cyd-daro â diwrnodau 3-4 ar ôl y chwistrelliad, pan oedd gweithgaredd ffosffatase wedi'i dawelu i'r eithaf (Data Estynedig Ffig. 2b).
Cafodd meinweoedd y mosgitos, gweddill y cadafariaid (gweddill y corff), neu'r corff cyfan eu dyrannu i mewn i 100% methanol a'u homogeneiddio â pheiriant gleinio (gleiniau gwydr 2 mm, 2,400 rpm, 90 eiliad). Roedd meintiau'r meinweoedd a chyfeintiau'r methanol fel a ganlyn: gweddill y corff, 50 mewn 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT benywaidd, 25–50 80 µl. Cafodd y gwaddod ei echdynnu â methanol am yr ail dro gyda'r un gyfaint o methanol. Cafodd malurion celloedd eu tynnu trwy allgyrchu. Cyfunwyd y methanol o'r ddau echdyniad a'i sychu o dan lif nitrogen, yna ei ail-atal yn y cyfeintiau canlynol o 80% methanol mewn dŵr: gweddill y corff, 50 µl; MAGs ac LRT benywaidd, 30 µl.
Dadansoddwyd samplau ar sbectromedr màs (ID-X, Thermo Fisher) wedi'i gyplysu ag offeryn LC (Vanquish, Thermo Fisher). Chwistrellwyd 5 µl o sampl i golofn 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) a gynhaliwyd ar 25 °C. Y cyfnodau symudol ar gyfer yr LC oedd A (dŵr, 0.1% asid fformig) a B (asetonitril, 0.1% asid fformig). Roedd graddiant yr LC fel a ganlyn: 5% B am 1 funud, yna cynyddwyd i 100% B dros 11 munud. Ar ôl 8 munud ar 100%, ail-gydbwyswch y golofn ar 5% B am 4 munud. Y gyfradd llif oedd 0.3 ml munud-1. Cyflawnir ïoneiddio yn y ffynhonnell MS trwy ïoneiddio electrochwistrellu wedi'i gynhesu mewn moddau positif a negatif.
Mae'r sbectromedr màs yn mesur data yn yr ystod m/z o 350 i 680 ar benderfyniad 60,000 mewn modd MS llawn. Cafwyd data MS/MS ar [M + H]+ (pob targed), [M - H2O + H]+ (pob targed), a [M - H]- (targedau ffosfforyleiddiedig). Defnyddiwyd data MS/MS i gadarnhau priodweddau ecdysone targedau nad oedd safon ar gael ar eu cyfer. I nodi ecdysteroidau heb eu targedu, dadansoddwyd data MS/MS ar gyfer pob copa HPLC gyda digonedd cymharol >15%. Mesurwch gan ddefnyddio cromliniau safonol a grëwyd o safonau pur (20E, 3D20E) i gyfrifo symiau absoliwt neu wanhadau o un sampl benodol (pob targed arall) i gyfrifo eu cywerthedd â'r symiau a geir mewn un gwryw. Ar gyfer 3D20E, perfformiwyd mesur gan ddefnyddio swm yr adducts canlynol: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Echdynnwyd a meintioli data gan ddefnyddio Tracefinder (fersiwn 4.1).Dadansoddwyd data MS/MS gan ddefnyddio Xcalibur (fersiwn 4.4).Cymharwyd sbectrwm MS E, 20E a 3D20E â'r safonau priodol.Dadansoddwyd 3D20E22P trwy ddeilliad gydag adweithydd Girard.Dadansoddwyd 20E22P yn ôl y gymhareb m/z.
Purowyd 3D20E22P o MAG. Perfformiwyd puro ar raddfa ddadansoddol gan ddefnyddio cromatograff hylif uwch-berfformiad (Acquity, Waters) gyda synhwyrydd màs cwadrpol (QDa, Acquity, Waters) o dan yr un amodau LC â'r dadansoddiad HPLC-MS/MS. Sbardunwyd casglu ffracsiynau pan ganfuwyd yr m/z sy'n cyfateb i 3D20E22P ar yr un amser cadw ag a bennwyd yn flaenorol. Yna gwiriwyd purdeb y cyfansoddion a echdynnwyd gan HPLC-MS/MS fel y disgrifiwyd uchod.
Echdynnwyd cyfanswm yr RNA o 10-12 o feinweoedd atgenhedlu neu rannau eraill o'r corff (di-ben) gan ddefnyddio adweithydd TRI (Thermo Fisher) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd yr RNA ei drin â TURBO DNase (Thermo Fisher). Cafodd cDNA ei syntheseiddio gan ddefnyddio trawsgrifiad gwrthdro firws lewcemia murine Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyhoeddwyd primerau ar gyfer PCR meintiol trawsgrifio gwrthdro (RT-qPCR; Tabl Data Estynedig 2) yn flaenorol24 neu eu cynllunio gan ddefnyddio Primer-BLAST26, gyda blaenoriaeth yn cael ei rhoi i gynhyrchion o 70-150 bp o ran maint ac yn rhychwantu cyffyrdd exon-exon neu mae primerau pâr primerau yn gwahanu exonau. Cafodd samplau cDNA o dri i bedwar dyblygiad biolegol eu gwanhau bedair gwaith mewn dŵr ar gyfer RT-qPCR. Perfformiwyd meintioli mewn adweithiau dyblygiad 15 µl yn cynnwys 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerau, a 5 µl o cDNA gwanedig. Rhedwyd adweithiau ar QuantStudio 6 Pro amser real. Casglwyd a dadansoddwyd system PCR (Thermo Fisher) a data gan ddefnyddio Dylunio a Dadansoddi (fersiwn 2.4.3). Fel y dangoswyd yn yr astudiaeth hon, normaleiddiwyd symiau cymharol i'r genyn ribosomaidd RpL19 (AGAP004422), nad oedd ei fynegiant yn newid yn sylweddol wrth fwydo â gwaed 27 na pharu 3.
Gwiriwyd ansawdd RNA gan ddefnyddio Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent). Paratowyd a rhedeg llyfrgelloedd pâr Illumina yn Sefydliad Broad MIT a Harvard. Cafodd darlleniadau dilyniannu eu halinio â genom A. gambiae (straen PEST, fersiwn 4.12) gan ddefnyddio HISAT2 (fersiwn 2.0.5) gyda pharamedrau diofyn. Tynnwyd darlleniadau gyda sgoriau ansawdd mapio (MAPQ) <30 gan ddefnyddio Samtools (fersiwn 1.3.1). Cyfrifwyd nifer y darlleniadau a fapiwyd i enynnau gan ddefnyddio htseq-count (fersiwn 0.9.1) gyda pharamedrau diofyn. Cyfrifwyd cyfrifon darlleniadau wedi'u normaleiddio a dadansoddwyd mynegiant genynnau gwahaniaethol gan ddefnyddio'r pecyn DESeq2 (fersiwn 1.28.1) yn R (fersiwn 4.0.3).
Nodwyd ymgeiswyr genynnau sy'n addasu ecdysone trwy chwilio'r genom A. gambiae yn gyntaf gan ddefnyddio'r algorithm PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), gan ddefnyddio gwerthoedd diofyn Paramedrau gyda'r dilyniannau protein ymholiad canlynol: o Bombyx mori (Rhif Mynediad NP_001038956.1), Musca domestica (Rhif Mynediad XP_005182020.1, XP_005175332.1 ac XP_011294434.1) a Microplitis demolitor (Rhif Mynediad XP_008552646.1 ac XP_008552645.1) EcK o B. mori (Rhif Mynediad NP_001036900), Drosophila melanogaster (Rhif Mynediad NP_651202), Apis mellifera (Rhif Mynediad XP_394838) ac Acyrthosiphon pisum (Rhif Mynediad XP_001947166); ac EPP o B. mori (Rhif Mynediad XP_001947166) NP_001177919.1 ac NP_001243996.1) ac EO o D. melanogaster (Rhif Mynediad NP_572986.1) (cam 1). Nesaf, hidlwch y canlyniadau yn seiliedig ar fynegiant mRNA uchel (>100 o ddarnau/ecsonau cilobas fesul miliwn o ddarlleniadau wedi'u mapio (FPKM) neu >85%) mewn meinwe atgenhedlu (LRT neu MAG benywaidd) yn Gambia (cam 2). Er mwyn gwella manylder, fe wnaethom ddewis ensymau ymgeisydd sydd hefyd yn cael eu mynegi ym meinwe atgenhedlu A. albimanus, rhywogaeth anopheles nad yw'n syntheseiddio nac yn trosglwyddo ecdysone yn ystod paru. Cafodd genynnau ymgeisydd eu hidlo yn seiliedig ar fynegiant isel (<100 FPKM neu <85fed ganradd) ym meinwe atgenhedlu A. albimanus (cam 3). Fel hidlydd terfynol (cam 4), mae angen i enynnau ymgeisydd fodloni o leiaf un o'r canlynol: (1) wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol ar ôl paru (P < 0.05) yn ôl y dadansoddiad o enynnau a fynegir yn wahanol a (2) mewn meinweoedd nad ydynt yn atgenhedlu (< 85% neu <100 FPKM).
Fe wnaethom addasu dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol 28,29,30 i gyflawni labelu isotopig organeb gyfan. Yn gryno, profwyd Saccharomyces cerevisiae math II gwyllt (YSC2, Sigma) mewn sylfaen nitrogen burum (BD Difco, DF0335) yn cynnwys (pwys/cyf) 2% glwcos (G7528, Sigma), 1.7% cyfrwng diwylliant di-asid amino ac amoniwm sylffad.) a 5% 15N amoniwm sylffad (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) fel yr unig ffynhonnell nitrogen. Adferwyd burum trwy allgyrchu a bwydwyd larfae mosgitos ad libitum tan iddynt chwilera. Ychwanegwyd blawd pysgod (0.5 mg fesul 300 o larfae) i atal marwolaethau yn y bedwaredd gyfnod. Yna dim ond benywod a ddefnyddiwyd mewn arbrofion paru gyda gwrywod heb eu labelu i ddadansoddi'r proteom gwrywaidd a drosglwyddwyd yn ystod paru.
Gorfodwyd benywod gwyryf 4-6 diwrnod oed â thag 15N i baru â gwrywod gwyryf heb dag o'r un oedran. Cadarnhawyd paru llwyddiannus trwy ganfod plygiau paru o dan ficrosgopeg epifflworoleuedd. Ar 3, 12, a 24 hpm, cafodd atria 45-55 o fenywod a barwyd eu dyrannu i 50 µl o fwffer amoniwm bicarbonad (pH 7.8) a'u homogeneiddio â phestl. Cafodd yr homogenad ei allgyrchu a chymysgwyd yr uwchnofiant â 50 µl o 0.1% RapiGest (186001860, Waters) mewn 50 mM amoniwm bicarbonad. Cafodd yr uwchnofiant a'r pelen o bob sampl eu rhewi'n gyflym ar rew sych a'u cludo dros nos i labordy MacCoss ym Mhrifysgol Washington, lle cwblhawyd paratoi samplau ar gyfer LC-MS/MS. Ail-ataliwch y pelen mewn 50 µl o 0.1% RapiGest mewn 50 mM amoniwm bicarbonad a soniciwch mewn baddon dŵr. Mesurwyd crynodiad protein y pelen a'r uwchnofiant gan y Assay BCA, cafodd samplau eu lleihau gyda 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), eu alkyleiddio gyda 15 mM iodoacetamid (Sigma) a'u deori ar 37 °C (1:0 50) am 1 awr gyda trypsineiddio: cymhareb trypsin:swbstrad). Cafodd RapiGest ei lysio trwy ychwanegu 200 mM HCl, ac yna ei ddeori ar 37 °C am 45 munud a'i allgyrchu ar 14,000 rpm am 10 munud ar 4 °C i gael gwared ar falurion. Cafodd samplau eu golchi trwy echdynnu cyfnod solet deuol-fodd (cetris Oasis MCX, Waters) ac eu hail-atal mewn asid fformig 0.1% ar gyfer crynodiad protein terfynol o 0.33 µg µl-1. Dadansoddwyd proteomau MAG heb eu labelu yn yr un modd o wrywod gwyryfon. Dadansoddwyd dau atgynhyrchiad dadansoddol ar gyfer pob sampl. Nesaf, dadansoddwyd 1 µg o bob un gan ddefnyddio colofn silica wedi'i asio 25-cm 75-μm gyda Trap ffrit silica wedi'i asio Kasil1 (PQ) 4-cm wedi'i bacio â resin cyfnod gwrthdro Jupiter C12 (Phenomenex) a chromatograffaeth hylif 180 munud. Treuliadau sampl – rhedwyd MS/MS ar sbectromedr màs HF Q-Exactive (Thermo Fisher) gyda System nanoACQUITY UPLC (Waters). Cafodd data caffael sy'n gysylltiedig â data a gynhyrchwyd ar gyfer pob rhediad ei drawsnewid i fformat mzML gan ddefnyddio Proteowizard (fersiwn 3.0.20287) a defnyddio Comet31 (fersiwn 3.2) yn erbyn cronfa ddata FASTA sy'n cynnwys dilyniannau protein o Anopheles gambiae (fersiwn 54 o VectorBase), Anopheles coluzzi. Perfformiwyd chwiliad ar Mali-NIH (fersiwn 54 o VectorBase), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mawrth 2021), RNA-seq A. gambiae, a chyfieithiadau tair ffrâm o halogion dynol hysbys. Penderfynwyd ar FDRs sy'n cyfateb i fap peptid gan ddefnyddio Percolator32 (fersiwn 3.05) gyda throthwy o 0.01, a chasglwyd peptidau i mewn i adnabyddiaethau protein gan ddefnyddio parsimoniaeth protein yn Limelight33 (fersiwn 2.2.0). Amcangyfrifwyd digonedd protein cymharol gan ddefnyddio'r ffactor digonedd sbectrol normaleiddiedig (NSAF) a gyfrifwyd ar gyfer pob protein ym mhob rhediad fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cyfartaleddwyd NSAF o'i gymharu â phob protein ar draws samplau o ddau atgynhyrchiad biolegol gwahanol. Llwyddodd labelu 15N i guddio'r proteom benywaidd, er y gellid canfod ychydig bach o brotein heb ei labelu o'r morynion wedi'u labelu. Cofnodwyd canfod gostyngiad protein gwrywaidd (sbectrwm 1-5) mewn samplau crai benywaidd yn unig mewn rhediadau technegol, lle rhedwyd samplau crai ar ôl samplau gwrywaidd/paru, o ganlyniad i "gario drosodd" HPLC. Rhestrir proteinau achlysurol a geir fel 'halogion' o forynion wedi'u labelu yn Nhabl Atodol 1.
Dau peptid antigenig, QTTDRVAPAPDQQQ (o fewn isoteip PA) a MESDGTTPSGDSEQ (o fewn isoteip PA a PB) yn Genscript. Cyfunwyd y ddau peptid, yna eu cysylltu â'r protein cludwr KLH a'u chwistrellu i gwningod Seland Newydd. Aberthwyd y cwningod ar ôl y pedwerydd pigiad, ac ynyswyd IgG cyfan trwy buro affinedd. Defnyddiwyd IgG o'r gwningen fwyaf penodol i EPP ar gyfer blotio gorllewinol pellach.
Ar gyfer blotiau gorllewinol, MAG (n = 10, lle mae n yn cynrychioli nifer y samplau mosgito sy'n fiolegol annibynnol) ac LRT benywaidd (n = 30) o wrywod gwyryf 4 diwrnod oed a benywod gwyryf neu fenywod a barwyd drwy orfodaeth (<10 ar ôl paru), ychwanegwyd byffer echdynnu protein (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodiwm deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; coctel atalydd proteas 1× (Roche)) ar wahân. Homogeneiddiwyd y samplau yn syth ar ôl eu dyrannu gyda gleiniau (gleiniau gwydr 2 mm, 2,400 rpm, 90 eiliad). Tynnwyd malurion anhydawdd trwy allgyrchu ar 20,000 g ar 4 °C. Mesurwyd y proteinau trwy assay Bradford (Bio-Rad). Yna, dadnatureiddiwyd a gwahanwyd 20 µg o brotein MAG, 40 µg o brotein LRT, a 20 µg o brotein swmp gweddilliol gan 10% Bis-Tris NuPAGE gan ddefnyddio byffer MOPS. Trosglwyddwyd proteinau i bilenni fflworid polyfinyliden gan ddefnyddio'r system drosglwyddo iBlot2 (Thermo Fisher). Golchwyd y pilenni ddwywaith mewn 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 mewn PBS) ac yna eu blocio mewn byffer blocio Odyssey (Li-Cor) am 1 awr ar 22°C. Ysgwydwyd y pilenni dros nos ar 4°C gyda gwrthgorff cynradd polyclonal cwningen gwrth-EPP personol (1:700 mewn byffer blocio) a gwrthgorff cynradd monoclonal llygoden fawr MAC237 (Abeam; 1:4,000). Golchwyd y pilenni gyda PBS-T ac yna eu magu gydag gwrthgyrff eilaidd (asyn gwrth-gwningen 800CW a gafr gwrth-lygoden fawr 680LT (Li-Cor), y ddau 1:20,000) mewn byffer blocio yn cynnwys 0.01% SDS a 0.2% Tween -20 am 1 awr ar 22 °C. Golchwyd y pilenni gyda PBS-T a'u delweddu gyda sganiwr Odyssey CLx. Casglwyd a phroseswyd delweddau yn Image Studio (fersiwn 5.2). Ni chanfuwyd band penodol sy'n cyfateb i'r isoform EPP-RA (82 kDa).
Cafodd rhanbarthau codio EPP (fel isoform AGAP002463-RB sy'n cynnwys parth ffosffatase histidin, chwiliad parth cadwedig NCBI 34) ac EcK2 (AGAP002181) eu clonio i mewn i blasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); rhestrir y primerau yn Nhabl Data Estynedig 2. Mewnosodwyd wyth cysylltydd GS4 (ar y cyd) cyn y tag 6xHis C-derfynol o'r adeiledd pET-21a(+)-EcK2. Cynhyrchwyd proteinau ailgyfunol gan ddefnyddio adwaith synthesis protein E. coli di-gelloedd NEBExpress (New England BioLabs). Purwyd proteinau ailgyfunol gan ddefnyddio colofnau sbin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Cynhyrchwyd protein rheoli dihydrofolate reductase (DHFR) gan ddefnyddio templed DNA o'r Pecyn Synthesis Protein E. coli Di-gelloedd NEBExpress. Storiwyd proteinau mewn 50% glyserol mewn PBS ar -20 °C am hyd at 3 mis.
Mesurwyd gweithgaredd ffosffatase EPP a darnau meinwe gan ddefnyddio ffosffad 4-nitrophenyl (pNPP; Sigma-Aldrich). Roedd y byffer adwaith yn cynnwys 25 mM Tris, 50 mM asid asetig, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ac 1 mM DTT. Homogeneiddiwyd y meinwe yn y byffer adwaith a thynnwyd malurion celloedd trwy allgyrchu. Dechreuwch yr adwaith trwy ychwanegu ensym neu ddarn meinwe at y byffer adwaith sy'n cynnwys 2.5 mg ml-1 pNPP. Deoriwyd y cymysgedd adwaith ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch, a meintioliwyd faint o pNP a drawsnewidiwyd o pNPP trwy fesur yr amsugnedd ar 405 nm ar wahanol adegau.
Ar gyfer gweithgaredd EcK in vitro, cafodd y protein ei ddeori gyda 0.2 mg o 20E neu 3D20E mewn 200 µl o glustog (pH 7.5) yn cynnwys 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP a 10 mM MgCl2 am 2 awr ar 27 °C. Cafodd yr adwaith ei atal trwy ychwanegu 800 µl o fethanol, yna ei oeri ar -20 °C am 1 awr, yna ei allgyrchu ar 20,000 g am 10 munud ar 4 °C. Yna dadansoddwyd yr uwchnofiant gan HPLC-MS/MS. I ddadactifadu'r proteinau a ddefnyddiwyd yn y grŵp rheoli â gwres, cafodd y proteinau eu deori mewn 50% glyserol mewn PBS am 20 munud ar 95 °C.
Ar gyfer gweithgaredd EPP in vitro, cafodd y protein ei ddeori gyda 3D20E22P (sy'n cyfateb i'r swm a geir mewn 18 pâr o MAG, wedi'i buro gan HPLC-MS/MS) mewn 100 µl o byffer (pH 7.5) yn cynnwys 25 mM Tris, 50 mM asid asetig, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ac 1 mM DTT am 3 awr ar 27 °C. Cafodd yr adwaith ei atal trwy ychwanegu 400 µl o fethanol a'i oeri ar -20 °C am 1 awr, yna ei allgyrchu ar 20,000 g am 10 munud ar 4 °C. Dadansoddwyd yr uwchnofiant gan HPLC-MS/MS.
Cafodd darnau PCR ar gyfer EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ac EcK2 (556 bp) eu mwyhau o cDNA a baratowyd o gyrff mosgito di-ben o rywiau cymysg. Cafodd darn PCR y rheolydd eGFP (495 bp) ei fwyhau o'r pCR2.1-eGFP a ddisgrifiwyd yn flaenorol; Rhestrir primerau PCR yn Nhabl Data Estynedig 2. Mewnosodwyd y darn PCR rhwng yr hyrwyddwyr T7 gwrthdro ar y plasmid pL4440. Adferwyd adeileddau plasmid o E. coli cymwys NEB 5-α (New England Biolabs) a'u gwirio trwy ddilyniannu DNA cyn eu defnyddio (gweler Data Atodol 1 am ddilyniant mewnosod). Defnyddiwyd primerau a barwyd â'r hyrwyddwr T7 (Tabl Data Estynedig 2) i fwyhau'r mewnosodiad o'r plasmid seiliedig ar pL4440. Cadarnhawyd maint cynnyrch PCR trwy electrofforesis gel agaros. Trawsgrifiwyd dsRNA o dempledi PCR gan ddefnyddio'r Pecyn Trawsgrifio Megascript T7 (Thermo Fisher) a'i buro yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr gyda'r addasiadau a ddisgrifiwyd yn flaenorol.
Ar gyfer chwistrelliad dsRNA, chwistrellwyd 1,380 ng o dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ar grynodiad o 10 ng nl-1 i thoracs oedolion gwrywaidd neu fenywaidd (Nanoject III, Drummond) o fewn 1 diwrnod ar ôl yr eclosure. Penderfynwyd lefelau cnocio genynnau mewn o leiaf dair dyblygiad biolegol trwy echdynnu RNA, synthesis cDNA, ac RT-qPCR. Ar gyfer chwistrelliad ecdysone, chwistrellwyd benywod gwyryfon 4 diwrnod oed neu 6 diwrnod oed a fwydwyd â gwaed â 0.13, 0.21, neu 0.63 µg o 20E neu 3D20E (Nanoject III, Drummond) ar grynodiadau o 1.3, 2.1, yn y drefn honno, yn dibynnu ar y dyluniad arbrofol neu 6.3 ng nl-1. Chwistrellwch 100 nl o ethanol 10% (cyf/cyf) mewn dŵr; 100 nl o 3D20E22P mewn ethanol 10% (sy'n cyfateb i 75% o'r swm a geir mewn pâr o MAGs). Neilltuwyd mosgitos ar hap i'r grŵp chwistrellu.
Ar gyfer asesiadau silio, bwydwyd benywod 3 diwrnod oed yn ôl eu galw ar waed dynol. Tynnwch fosgitos a fwydwyd yn rhannol neu heb eu bwydo. Yn dibynnu ar y driniaeth, gosodwyd benywod mewn cwpanau silio ar wahân am bedair noson o leiaf 48 awr ar ôl y pryd gwaed. Cyfrifwyd wyau o dan stereosgop (Stemi 508, Zeiss); ar gyfer benywod a barwyd, ystyriwyd bod wyau a ddeorodd yn larfa yn ffrwythlon.
Ar gyfer treialon paru, caniatawyd o leiaf 2 ddiwrnod i'r benywod ddatblygu ymwrthedd i baru, yn dibynnu ar y driniaeth, ac yna cyflwynwyd gwrywod tebyg i oedran y math gwyllt i'r un cawell. Ddwy noson yn ddiweddarach, cafodd y fesiglau benywaidd a gafodd eu ffrwythloni eu dyrannu a rhyddhawyd DNA genomig trwy rewi-dadmer a sonication mewn byffer yn cynnwys 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, a 25 mM NaCl (pH 8.2). Cafodd samplau eu meithrin gyda Proteinase K (0.86 µg µl-1) am 15 munud ar 55 °C, ac yna 10 munud ar 95 °C. Cafodd paratoadau DNA genomig crai eu gwanhau 10 gwaith a'u rhoi dan ganfod qPCR o ddilyniannau cromosom Y; rhestrir y primerau yn Nhabl Data Estynedig 2. Mae absenoldeb dilyniant cromosom Y yn dynodi dim paru.
Ar gyfer asesiadau ail-baru, archwiliwyd benywod a barwyd drwy orfodaeth am bresenoldeb plygiau paru i gadarnhau statws paru a chaniatawyd 2 ddiwrnod iddynt ddatblygu anhydrinedd i baru yn absenoldeb gwrywod, fel y disgrifiwyd yn flaenorol 36. Yna cyflwynwyd gwrywod yn cario sberm trawsgenig DsRed i gewyll benywaidd. Ddwy noson yn ddiweddarach, dyrannwyd y fesiglau ffrwythloni o'r benywod, a pharatowyd DNA genomig fel y disgrifiwyd uchod a'i destun i ganfod qPCR o'r trawsgen DsRed; rhestrir y primerau yn Nhabl Data Estynedig 2. Roedd absenoldeb y trawsgen DsRed yn dangos nad oedd unrhyw ail-baru wedi digwydd.
Syntheseiddiwyd 3D20E fel y disgrifiwyd yn flaenorol 37. Yn gryno, diddymwyd 10 mg o 20E (Sigma-Aldrich) mewn 10 ml o ddŵr, ac yna ychwanegwyd 30 mg o blatinwm du (ar ffurf powdr, Sigma-Aldrich). Swigodwyd ffrwd ysgafn o O2 yn barhaus i'r cymysgedd adwaith, a gafodd ei droi ar dymheredd ystafell. Ar ôl 6 awr, ychwanegwyd 30 mL o fethanol i atal yr adwaith. Cafodd y cymysgedd ei allgyrchu i gael gwared ar ronynnau catalydd. Anweddwyd yr uwchnofiant i sychder mewn gwactod ar dymheredd ystafell. Diddymwyd y cynnyrch adwaith sych mewn ethanol 10% a methanol i'w chwistrellu ar gyfer dadansoddiad HPLC-MS/MS. Roedd y gyfradd drosi (o 20E i 3D20E) tua 97% (Ffig. 4b), ac roedd sbectrwm MS y 3D20E wedi'i syntheseiddio yn cyfateb i'r hyn a geir mewn benywod wedi paru (Ffig. 4c).
Mae'r allwedd yn cynnwys manylion penodol am y profion ystadegol a gynhaliwyd. Defnyddiwyd GraphPad (fersiwn 9.0) i berfformio prawf union Fisher, prawf Mantel-Cox, a phrawf-t Student. Perfformiwyd profion Cochran-Mantel-Haenszel gan ddefnyddio sgript R wedi'i deilwra (ar gael yn https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Profwyd y dosbarthiad data am normalrwydd gan ddefnyddio'r prawf Shapiro-Wilk gyda throthwy arwyddocâd o 0.05. Pan fethodd y data y prawf normalrwydd, perfformiwyd y prawf Mann-Whitney. Dadansoddwyd data goroesi gan ddefnyddio'r prawf Mantel-Cox. Defnyddiwyd y pecyn DESeq2 (fersiwn 1.28.1) i berfformio dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol lefel genynnau RNA-seq. Mae'r bar llorweddol ar y graff yn cynrychioli'r canolrif. Defnyddiwyd gwerth arwyddocâd o P = 0.05 fel y trothwy ar gyfer pob prawf.
Am ragor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler crynodeb yr Adroddiad Ymchwil Natur sydd wedi'i gysylltu â'r erthygl hon.
Adneuwyd data proteomig MS i Gonsortiwm ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) trwy Storfa Partner PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) gyda'r dynodwr set ddata PXD032157.
Mae'r set ddata RNA-seq wedi'i hadneuo yn y Llyfrgell Gynhwysfawr Mynegiant Genynnau (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) o dan y cofnod cyfresol GSE198665.
Gellir cael setiau data ychwanegol a gynhyrchwyd a/neu a ddadansoddwyd yn ystod yr astudiaeth gyfredol gan yr awduron cyfatebol ar gais rhesymol. Mae'r erthygl hon yn darparu'r data ffynhonnell.
De Loof, A. Ecdysteroidau: Steroidau rhyw pryfed wedi'u hesgeuluso?Gwryw: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone a datblygiad ofarïaidd yn Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).