Mae Javascript wedi'i analluogi yn eich porwr ar hyn o bryd. Ni fydd rhai nodweddion y wefan hon yn gweithio pan fydd javascript wedi'i analluogi.
Cofrestrwch gyda'ch manylion penodol a'r cyffur penodol sydd o ddiddordeb i chi a byddwn yn paru'r wybodaeth a ddarparwch ag erthyglau yn ein cronfa ddata helaeth ac yn e-bostio copi PDF atoch ar unwaith.
Mae gronynnau Ban-Lan-Gen yn gwanhau colitis cronig atglafychol a achosir gan sodiwm sylffad dextran mewn llygod trwy addasu microbiota'r perfedd ac adfer cynhyrchiad GLP-1 sy'n deillio o SCFA yn y berfedd.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Adran Fferylliaeth Ysbyty Prifysgol Peking Shenzhen, Shenzhen, Gweriniaeth Pobl Tsieina; 2Canolfan Gwyddor Iechyd Prifysgol Shenzhen Ysgol Fferylliaeth, Shenzhen, Gweriniaeth Pobl Tsieina; 3Canolfan Ymchwil Technoleg Beirianneg Prifysgol Feddygol Guizhou ar gyfer Datblygu a Chymhwyso Meddygaeth Ethnig a Meddygaeth Tsieineaidd Traddodiadol, y Weinyddiaeth Addysg, Labordy Allweddol Fferylliaeth Talaith Guizhou, Prifysgol Feddygol Guizhou, Guiyang, Gweriniaeth Pobl Tsieina; 4 Adran Gastroenteroleg, Ysbyty Prifysgol Peking Shenzhen, Shenzhen, Gweriniaeth Pobl Tsieina; 5 Ysgol Fferylliaeth, Prifysgol Feddygol Guizhou, Labordy Allweddol y Wladwriaeth ar gyfer Swyddogaeth a Chymhwyso Planhigion Meddyginiaethol, Guiyang; 6 Adran Meddygaeth Labordy, Ysbyty Prifysgol Peking Shenzhen, Shenzhen, Tsieina [email protected] Shen Xiangchun, Ysgol Fferylliaeth, Prifysgol Feddygol Guizhou, Guizhou, Gweriniaeth Pobl Tsieina, 550004, E-bost [email protected] Amcan: Mae therapi sy'n seiliedig ar GLP-1 yn opsiwn triniaeth newydd ar gyfer clefyd llidiol y coluddyn. Mae gronynnau Ban-Lan-Gen (BLG) yn fformiwleiddiad gwrthfeirysol TCM hysbys sy'n arddangos gweithgaredd gwrthlidiol posibl wrth drin amrywiol gyflyrau llidiol. Fodd bynnag, mae ei effaith gwrthlidiol ar golitis a'i fecanwaith gweithredu yn dal yn aneglur. DULLIADAU: Sefydlu colitis cronig atglafychol a achosir gan sodiwm sylffad dextran (DSS) mewn llygod. Perfformiwyd mynegeion gweithgaredd clefydau, marcwyr histolegol anaf, a lefelau cytocin pro-llidiol i asesu effaith amddiffynnol BLG. Nodweddwyd effeithiau BLG ar ficrobiota'r perfedd a'r perfedd gan lefelau GLP-1 serwm a mynegiant Gcg, GPR41, a GRP43 y colon, cyfansoddiad microbiota'r perfedd, lefelau SCFAs fecal, a rhyddhau GLP-1 o Cynhyrchu GLP-1 sy'n deillio o SCFA mewn celloedd epithelaidd colonaidd llygoden gynradd. Canlyniadau: Gostyngodd triniaeth BLG golli pwysau'r corff, DAI, byrhau'r colon, difrod i feinwe'r colon, a lefelau cytocin pro-llidiol TNF-α, IL-1β, ac IL-6 ym meinwe'r colon yn sylweddol. Yn ogystal, gall triniaeth BLG adfer mynegiant Gcg, GPR41 a GRP43 y colon a lefelau GLP-1 serwm mewn llygod colitis yn sylweddol, a thrwy gynyddu bacteria sy'n cynhyrchu SCFA fel Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, a lleihau nifer y bacteria fel Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ac Oscillibacter. Yn ogystal, gall triniaeth BLG gynyddu lefel yr SCFA yn sylweddol yng ngharthion llygod colitis. Ar yr un pryd, dangosodd arbrofion in vitro hefyd y gall dyfyniad carthion llygod a gafodd driniaeth BLG ysgogi'n fawr y celloedd epithelaidd colonaidd bach Murine cynradd sy'n secretu GLP-1. Casgliadau: Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod gan BLG effaith gwrth-colitis. Mae gan BLG y potensial i gael ei ddatblygu fel therapi, o leiaf yn rhannol trwy addasu microbiota'r perfedd ac adfer cynhyrchiad GLP-1 sy'n deillio o SCFA yn y coluddyn. Cyffuriau addawol ar gyfer colitis cronig atglafychol. Allweddeiriau: colitis, gronynnau Ban-Lan-Gen, microbiota'r perfedd, asidau brasterog cadwyn fer, GLP-1
Mae colitis briwiol (UC) yn glefyd llidiol hirdymor y colon a'r rectwm a nodweddir gan ddolur rhydd rheolaidd, poen yn yr abdomen, colli pwysau, a charthion gwaedlyd mwcopurulent.1 Yn ddiweddar, mae nifer yr achosion o UC wedi bod yn cynyddu mewn gwledydd a oedd gynt yn isel eu niferoedd, gan gynnwys Tsieina, gyda phoblogrwydd cynyddol ffyrdd o fyw'r Gorllewin.2 Mae'r cynnydd hwn yn peri problemau mawr i iechyd y cyhoedd ac mae ganddo oblygiadau difrifol i allu cleifion i weithio ac ansawdd bywyd. Yn nodedig, mae pathogenesis UC yn parhau i fod yn aneglur i raddau helaeth, ond derbynnir yn gyffredinol bod geneteg, ffactorau amgylcheddol, microbiota'r perfedd, a'r system imiwnedd i gyd yn cyfrannu at ddatblygiad UC.3 Hyd yn oed nawr, nid oes iachâd ar gyfer UC, a nod y driniaeth yn glinigol yw rheoli symptomau clinigol, ysgogi a chynnal rhyddhad, hyrwyddo iachâd mwcosaidd, a lleihau ailddigwyddiad. Mae triniaethau clasurol yn cynnwys aminosalicylates, corticosteroidau, imiwnosuppressants, a biolegau. Fodd bynnag, ni all y cyffuriau hyn gyflawni'r effaith a ddymunir oherwydd eu gwahanol sgîl-effeithiau.4 Yn ddiweddar, mae llawer o astudiaethau achos wedi dangos bod meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol (TCM) wedi dangos potensial mawr i helpu i leddfu UC gyda gwenwyndra isel, gan awgrymu bod datblygu therapïau TCM newydd yn strategaeth driniaeth addawol ar gyfer UC.5-7
Mae Granules Banlangen (BLG) yn baratoad meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol a wneir o echdyniad dŵr gwreiddyn Banlangen.8 Yn ogystal â'i effeithiolrwydd gwrthfeirysol, mae BLG yn arddangos gweithgaredd gwrthlidiol posibl wrth drin amrywiol gyflyrau llidiol.9,10 Yn ogystal, mae glwcosinolatau (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin a glwcoside wedi'u hynysu a'u hadnabod o echdyniad dyfrllyd o Radix isatidis) a niwcleosidau (hypoxanthine, adenosine, uridine a guanosine) ac alcaloidau indigo fel indigo ac indirubin.11,12 Mae astudiaethau blaenorol wedi dogfennu'n dda bod y cyfansoddion adenosine, uridine ac indirubin yn arddangos effeithiau gwrth-colitis cryf mewn gwahanol fodelau anifeiliaid o golitis.13-17 Fodd bynnag, ni chynhaliwyd unrhyw astudiaethau seiliedig ar dystiolaeth i werthuso effeithiolrwydd BLG mewn colitis. Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom ymchwilio i effaith amddiffynnol BLG ar golitis cronig atglafychol a achosir gan sodiwm sylffad dextran (DSS) mewn llygod C57BL/6. a chanfuwyd bod gweinyddiaeth lafar o BLG yn lleihau llid cronig atglafychol y colon a achosir gan DSS yn sylweddol mewn llygod, mae ei fecanweithiau rheoleiddio yn gysylltiedig â modiwleiddio microbiota'r perfedd ac adfer cynhyrchiad peptid tebyg i glwcagon-1 (GLP-1) sy'n deillio o'r perfedd.
Prynwyd gronynnau BLG (di-siwgr, wedi'u cymeradwyo gan NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, Tsieina; rhif swp: 20110966) o fferyllfeydd. Prynwyd DSS (Pwysau Moleciwlaidd: 36,000–50,000 Dalton) gan MP Biologicals (Santa Ana, UDA). Prynwyd sylffasalazin (SASP) (purdeb ≥ 98%), hematoxylin ac eosin gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd citiau assay llygoden TNF-α, IL-1β ac IL-6 luminex Elisa gan systemau Ymchwil a Datblygu (Minneapolis, MN, UDA). Prynwyd asid asetig, asid propionig, ac asid butyrig gan Aladdin Industries (Shanghai, Tsieina). Prynwyd asid 2-ethylbutyrig gan Merck KGaA (Darmstadt, yr Almaen).
Prynwyd llygod gwrywaidd C57BL/6 6-8 wythnos oed (pwysau corff 18-22 g) gan Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, Tsieina) a'u lletya mewn amgylchedd o 22 ± 2 °C gyda chylchred golau/tywyllwch 12 awr. Bwydwyd diet cnofilod safonol i'r llygod gyda mynediad rhydd at ddŵr yfed am wythnos i addasu i'r amgylchedd newydd. Yna rhannwyd y llygod ar hap yn bedwar grŵp: grŵp rheoli, grŵp model DSS, grŵp a gafodd driniaeth SASP (200 mg/kg, llafar) a grŵp a gafodd driniaeth BLG (1 g/kg, llafar). Fel y dangosir yn Ffigur 1A, yn ôl ein hastudiaeth flaenorol, ysgogwyd colitis cronig atglafychol arbrofol mewn llygod gan dri chylchred o 1.8% DSS am 5 diwrnod, ac yna dŵr distyll am 7 diwrnod, yn ôl ein hastudiaeth flaenorol.18 Cafodd llygod yn y grwpiau a gafodd driniaeth SASP a BLG eu trin â SASP a BLG, yn y drefn honno, bob dydd gan ddechrau o ddiwrnod 0. Yn ôl arbrofion rhagarweiniol, dos y Gosodwyd BLG ar 1 g/kg. Yn y cyfamser, gosodwyd dos SASP ar 200 mg/Kg yn ôl y llenyddiaeth.4 Derbyniodd y grwpiau rheoli a'r grwpiau model DSS yr un gyfaint o ddŵr drwy gydol yr arbrawf.
Ffigur 1 Mae BLG yn gwella colitis cronig atglafychol a achosir gan DSS mewn llygod. (A) Cynllun arbrofol colitis cronig atglafychol a thriniaeth, (B) newid pwysau'r corff, (C) sgôr mynegai gweithgaredd clefyd (DAI), (D) hyd y colon, (E) delwedd gynrychioliadol o'r colon, (F) staenio H&E y colon (chwyddiad, ×100) a (G) sgôr histolegol. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 6). ##p < 0.01 neu ###p < 0.001 vs grŵp rheoli (Con); *p < 0.05 neu **p < 0.01 neu ***p < 0.001 vs grŵp DSS.
Cofnodwyd pwysau'r corff, cysondeb y carthion, a gwaedu'r rectwm yn ddyddiol. Penderfynwyd mynegai gweithgaredd clefydau (DAI) trwy gyfuno sgoriau pwysau'r corff, cysondeb y carthion, a gwaedu'r rectwm fel y disgrifiwyd yn flaenorol.19 Ar ddiwedd yr arbrawf, cafodd pob llygoden eu lladd a chasglwyd gwaed, carthion a cholon ar gyfer arbrofion pellach.
Cafodd meinwe'r colon ei gosod â formalin a'i mewnosod mewn paraffin. Gwnaed adrannau 5-micron a'u staenio â hematoxylin-eosin (H&E), yna eu dallu a'u sgorio fel y disgrifiwyd yn flaenorol.19
Cafodd cyfanswm RNA meinwe'r colon ei echdynnu gan ddefnyddio adweithydd Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), ac yna echdynnu cDNA gyda thranscriptase gwrthdro (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Perfformiwyd PCR meintiol gan ddefnyddio system PCR amser real gyda SYBR Green Master (Roche, Basel, y Swistir). Cafodd trawsgrifiadau genynnau targed eu normaleiddio i β-actin a dadansoddwyd data gan ddefnyddio'r dull 2-ΔΔCT. Dangosir dilyniannau primer y genynnau yn Nhabl 1.
Perfformiwyd ynysu a diwylliant celloedd epithelaidd colonaidd llygoden gynradd fel y disgrifiwyd yn flaenorol.20 Yn gryno, torrwyd colonau llygod 6-8 wythnos oed yn gyntaf ar ôl eu haberthu trwy ddatgymaliad serfigol, yna eu hagor yn hydredol, eu trin â Thoddiant Halen Cytbwys Hanks (HBSS, heb galsiwm a magnesiwm) a'u torri'n ddarnau bach 0.5-1 mm. Wedi hynny, treuliwyd meinweoedd gyda 0.4 mg/mL o golagenase XI (Sigma, Poole, DU) mewn cyfrwng DMEM rhydd a'u centrifugio ar 300 xg am 5 munud ar dymheredd ystafell. Ail-ataliwyd y belen mewn cyfrwng DMEM (wedi'i ategu â 10% serwm buchol ffetws, 100 Uned/mL penisilin, a 100 µg/mL streptomycin) ar 37 °C a'i basio trwy rwyll neilon (maint mandwll ~250 µm). Gosodwyd darnau bach o gelloedd epithelaidd colonaidd mewn dysglau gwaelod gwydr a'u deori gydag asid asetig, asid propionig, asid butyrig, a llygoden. dyfyniadau fecal am 2 awr ar 37°C, 5% CO2.
Homogeneiddiwyd meinwe'r colon gyda PBS, a chanfuwyd lefelau'r cytocinau IL-6, TNF-α ac IL-1β ym meinwe'r colon gan ddefnyddio citiau assay ELISA luminex (systemau Ymchwil a Datblygu, Minneapolis, MN, UDA). Yn yr un modd, penderfynwyd lefelau GLP-1 mewn serwm a chyfrwng diwylliant celloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd gyda phecyn ELISA (Bioswamp, Wuhan, Tsieina) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Cafodd cyfanswm y DNA o feces ei echdynnu gan ddefnyddio pecyn echdynnu DNA (Tiangen, Tsieina). Mesurwyd ansawdd a maint y DNA ar gymhareb o 260 nm/280 nm a 260 nm/230 nm, yn y drefn honno. Wedi hynny, gan ddefnyddio pob DNA a echdynnwyd fel templed, defnyddiwyd y primerau penodol 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ac 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) i fwyhau rhanbarthau V3-V4 y genyn rRNA 16S mewn gwahanol ranbarthau. Cafodd cynhyrchion PCR eu puro gan ddefnyddio'r Pecyn Echdynnu Gel QIAquick (QIAGEN, yr Almaen), eu meintioli gan PCR amser real, a'u dilyniannu gan ddefnyddio'r platfform dilyniannu IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, UDA). Ar gyfer dadansoddi biowybodeg, perfformiwyd prosesu data gan ddilyn protocolau a adroddwyd yn flaenorol.21,22 Yn fyr, defnyddiwch Cutadapt (V1.9.1) i hidlo ffeiliau mynegi amrwd. Cafodd OTUs eu clystyru gan ddefnyddio UPARSE (fersiwn 7.0.1001) gyda thorbwynt tebygrwydd o 97%, a defnyddiwyd UCHIME i gael gwared ar ddilyniannau chimerig. Perfformiwyd dadansoddiad a dosbarthiad cyfansoddiad cymunedol gan ddefnyddio'r dosbarthwr RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) yn seiliedig ar gronfa ddata genynnau RNA ribosomaidd SILVA.
Mesurwyd lefelau asidau brasterog cadwyn fer (asid asetig, asid propionig, ac asid butyrig) fel y disgrifiwyd yn flaenorol gan Tao et al., gyda rhai addasiadau.23 Yn gryno, ataliwyd 100 mg o feces yn gyntaf mewn 0.4 mL o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio, ac yna 0.1 mL o asid sylffwrig 50% a 0.5 mL o asid 2-ethylbutyrig (safon fewnol), yna eu homogeneiddio a'u gwresogi ar 4°C. Allgyrchwch ar 12,000 rpm am 15 munud ar C. Cafodd yr uwchnofiant ei echdynnu gyda 0.5 mL o ether a'i chwistrellu i'r GC i'w ddadansoddi. Ar gyfer dadansoddi cromatograffaeth nwy (GC), dadansoddwyd samplau gan ddefnyddio cromatograff nwy GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) wedi'i gyfarparu â synhwyrydd ïoneiddio fflam (FID). Cyflawnwyd gwahanu gan ddefnyddio colofn ZKAT-624, 30 m × 0.53 mm × 0.3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Tsieina). Cafwyd data gan ddefnyddio meddalwedd datrysiad GC (Shimadzu, Inc.). Roedd y gymhareb hollti yn 10:1, nitrogen oedd y nwy cludwr, a'r gyfradd llif oedd 6 mL/mun. Roedd cyfaint y chwistrelliad yn 1 μL. Roedd tymheredd y chwistrellwr a'r synhwyrydd yn 300°C. Cadwyd tymheredd y popty ar 140°C am 13.5 munud, yna cynyddwyd i 250°C ar gyfradd o 120°C/mun; cadwyd y tymheredd am 5 munud.
Cyflwynir data fel cymedr ± gwall safonol y cymedr (SEM). Aseswyd arwyddocâd data gan ANOVA unffordd ac yna prawf aml-ystod Duncan. Defnyddiwyd meddalwedd GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, UDA) ar gyfer yr holl gyfrifiadau ac ystyriwyd bod p < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.
Mae'n hysbys bod colitis cronig atglafychol yn glefyd colitis cronig atglafychol gyda phoen abdomenol difrifol, dolur rhydd a gwaedu. Felly, sefydlwyd colitis cronig atglafychol a achosir gan DSS mewn llygod i werthuso effeithiolrwydd gwrth-colitis BLG (Ffig. 1A). O'i gymharu â'r grŵp rheoli, roedd gan lygod yn y grŵp model DSS bwysau corff is yn sylweddol a DAI uwch, ac roedd y newidiadau hyn wedi'u gwrthdroi'n sylweddol ar ôl 24 diwrnod o driniaeth BLG (Ffigur 1B a C). Mae byrhau'r colon yn nodwedd bwysig o UC. Fel y dangosir yn Ffigurau 1D ac E, roedd hyd colon llygod a dderbyniodd DSS wedi'i fyrhau'n sylweddol, ond cawsant eu lleddfu gan driniaeth BLG. Wedi hynny, perfformiwyd dadansoddiad histopatholegol i asesu llid y colon. Dangosodd delweddau lliw H&E a sgoriau patholegol fod gweinyddiaeth DSS wedi tarfu'n sylweddol ar bensaernïaeth y colon ac wedi arwain at ddinistrio'r crypt, tra bod triniaeth BLG wedi lleihau dinistrio'r crypt a sgoriau patholegol yn sylweddol (Ffigur 1F a G). Yn nodedig, roedd effaith amddiffynnol BLG ar ddos ​​o 1 g/Kg yn gymharol ag effaith SASP ar ddos ​​o 200 mg/Kg. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod BLG yn effeithiol wrth leihau difrifoldeb colitis atglafychol cronig a achosir gan DSS mewn llygod.
Mae TNF-α, IL-1β ac IL-6 yn farcwyr llidiol pwysig o lid y colon. Fel y dangosir yn Ffigur 2A, fe wnaeth DSS achosi cynnydd sylweddol yn mynegiant genynnau TNF-α, IL-1β ac IL-6 yn y colon o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Gall gweinyddu BLG wrthdroi'r newidiadau hyn a gyfryngir gan DSS yn sylweddol. Nesaf, fe wnaethom ddefnyddio ELISA i bennu lefelau'r cytocinau llidiol TNF-α, IL-1β, ac IL-6 ym meinwe'r colon. Dangosodd y canlyniadau hefyd fod lefelau colonaidd TNF-α, IL-1β, ac IL-6 wedi cynyddu'n sylweddol mewn llygod a gafodd eu trin â DSS, tra bod triniaeth BLG wedi lleddfu'r cynnydd hwn (Ffigur 2B).
Ffigur 2 Mae BLG yn atal mynegiant genynnau a chynhyrchu'r cytocinau llidiol TNF-α, IL-1β ac IL-6 yng ngholon llygod sydd wedi cael eu trin â DSS. (A) Mynegiant genynnau colonaidd TNF-α, IL-1β ac IL-6; (B) lefelau protein colonaidd TNF-α, IL-1β ac IL-6. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 4–6). #p < 0.05 neu ##p < 0.01 neu ###p < 0.001 vs grŵp rheoli (Con); *p < 0.05 neu **p < 0.01 vs grŵp DSS.
Mae dysbiosis berfeddol yn hanfodol ym pathogenesis UC.24 Er mwyn ymchwilio i weld a yw BLG yn modiwleiddio microbiota perfedd llygod a gafodd eu trin â DSS, perfformiwyd dilyniannu rRNA 16S i ddadansoddi cymuned bacteriol cynnwys y perfedd. Mae'r diagram Venn yn dangos bod y tri grŵp yn rhannu 385 OTU. Ar yr un pryd, roedd gan bob grŵp OTU unigryw (Ffig. 3A). Ar ben hynny, dangosodd mynegai Chao1 a mynegai Shannon a ddangosir yn Ffigur 3B a C fod amrywiaeth gymunedol microbiota'r perfedd wedi'i leihau mewn llygod a gafodd eu trin â BLG, gan fod mynegai Shannon wedi gostwng yn sylweddol yn y grŵp a gafodd eu trin â BLG. Defnyddiwyd dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA) a dadansoddiad cyfesurynnau pennaf (PCoA) i bennu patrymau clwstwr ymhlith y tri grŵp a dangosodd fod strwythur cymunedol llygod a gafodd eu trin â DSS wedi'i wahanu'n glir ar ôl triniaeth BLG (Ffigur 3D ac E). Mae'r data hyn yn awgrymu bod triniaeth BLG wedi effeithio'n sylweddol ar strwythur cymunedol llygod â cholitis a achosir gan DSS.
Ffigur 3 Mae BLG yn newid amrywiaeth microbiota'r perfedd mewn llygod â cholitis a achosir gan DSS. (A) Diagram Venn o OTU, (B) Mynegai Chao1, (C) Mynegai cyfoeth Shannon, (D) Plot sgôr Dadansoddiad Cydran Brif (PCA) o OTU, (E) Ffigur sgôr Dadansoddiad Cyfesurynnau Brif OTU (PCoA). Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 6). **p < 0.01 vs grŵp DSS.
Er mwyn asesu newidiadau penodol yn y microbiota fecal, dadansoddwyd cyfansoddiad microbiota'r perfedd ar bob lefel tacsonomig. Fel y dangosir yn Ffigur 4A, y prif ffyla ym mhob grŵp oedd Firmicutes a Bacteroidetes, ac yna Verrucomicrobia. Cynyddwyd niferoedd cymharol Firmicutes a chymhareb Firmicutes/Bacteroidetes yn sylweddol yng nghymunedau microbaidd fecal llygod a gafodd eu trin â DSS o'i gymharu â llygod rheoli, a gwrthdrowyd y newidiadau hyn yn sylweddol ar ôl triniaeth BLG. Yn benodol, cynyddodd triniaeth BLG niferoedd cymharol Verrucobacterium yn sylweddol yng nghymunedau microbaidd fecal llygod â cholitis a achosir gan DSS. Ar lefel yr aelwyd, roedd cymunedau microbaidd fecal wedi'u meddiannu gan Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae a Prevotellaceae (Ffig. 4B). O'i gymharu â'r grŵp DSS, cynyddodd disbyddu BLG niferoedd Akkermansiaceae, ond gostyngodd niferoedd Lachnospiraceae a Ruminococcaceae. Yn nodedig, ar lefel y genws, Roedd y microbiota fecal wedi'i feddiannu gan Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001 (Ffig. 4C). Dangosodd y canfyddiad hwn hefyd fod triniaeth BLG wedi gwrthdroi anghydbwysedd y microbiota yn effeithiol mewn ymateb i her DSS, a nodweddir gan ostyngiad yn Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ac Oscillibacter, a chynnydd yn Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001.
Ffigur 4 Mae BLG yn newid helaethrwydd microbiota'r perfedd mewn llygod a achosir gan colitis DSS. (A) Digonedd microbiota'r perfedd ar lefel y ffylwm; (B) Digonedd microbiota'r perfedd ar lefel y teulu; (C) Digonedd microbiota'r perfedd ar lefel y genws. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 6). #p < 0.05 neu ###p < 0.001 vs grŵp rheoli (Con); *p < 0.05 neu **p < 0.01 neu ***p < 0.001 vs grŵp DSS.
O ystyried mai asidau brasterog cadwyn fer (SCFAs) yw prif fetabolion Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, tra bod asetat, propionad a butyrad yn yr SCFAs mwyaf niferus yn lumen y berfedd, 25-27 rydym yn dal yn ein hastudiaeth. Fel y dangosir yn Ffigur 5, gostyngwyd crynodiadau asetat fecal, propionad, a butyrad yn sylweddol yn y grŵp a gafodd driniaeth DSS, tra gallai triniaeth BLG atal y gostyngiad hwn i raddau helaeth.
Ffigur 5. Mae BLG yn cynyddu lefelau SCFAs yn feces llygod â cholitis a achosir gan DSS. (A) Cynnwys asid asetig yn y feces; (B) cynnwys asid propionig yn y feces; (C) cynnwys asid butyrig yn y feces. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 6). #p < 0.05 neu ##p < 0.01 vs grŵp rheoli (Con); *p < 0.05 neu **p < 0.01 vs grŵp DSS.
Fe wnaethom gyfrifo ymhellach y cyfernod cydberthynas Pearson rhwng SCFA gwahaniaethol lefel genws a microbiota fecal. Fel y dangosir yn Ffigur 6, roedd Akkermansia yn gysylltiedig yn gadarnhaol â chynhyrchu asid propionig (Pearson = 0.4866) ac asid butyrig (Pearson = 0.6192). Mewn cyferbyniad, roedd Enteromonas ac Oscillobacter ill dau yn gysylltiedig yn negyddol â chynhyrchu asetat, gyda chyfernodau Pearson o 0.4709 a 0.5104, yn y drefn honno. Yn yr un modd, roedd Ruminococcaceae_UCG-014 yn gysylltiedig yn negyddol â chynhyrchu asid propionig (Pearson = 0.4508) ac asid butyrig (Pearson = 0.5842), yn y drefn honno.
Ffigur 6 Dadansoddiad cydberthynas Pearson rhwng SCFAs gwahaniaethol a microbau colonaidd. (A) Enteromonas gydag asid asetig; (B) Bacilws cyfergyd gydag asid asetig; (C) Akkermansia vs asid propionig; (D) Ruminococcus_UCG-014 gydag asid propionig; (E) Akkermansia gydag asid butyrig; (F) ) Ruminococcus _UCG-014 gydag asid butyrig.
Mae peptid tebyg i glwcagon-1 (GLP-1) yn gynnyrch ôl-gyfieithiadol penodol i fath celloedd o proglwcagon (Gcg) gyda phriodweddau gwrthlidiol.28 Fel y dangosir yn Ffigur 7, fe wnaeth DSS achosi gostyngiad sylweddol yn mynegiant mRNA Gcg. Gallai triniaeth y colon a BLG wrthdroi'r gostyngiad Gcg a achosir gan DSS yn sylweddol o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. 7A). Ar yr un pryd, gostyngwyd lefel GLP-1 mewn serwm yn sylweddol yn y grŵp a gafodd driniaeth DSS, a gallai triniaeth BLG atal y gostyngiad hwn i raddau helaeth (Ffig. 7B). Gan y gall asidau brasterog cadwyn fer ysgogi secretiad GLP-1 trwy actifadu derbynnydd cysylltiedig â phrotein G 43 (GRP43) a derbynnydd cysylltiedig â phrotein G 41 (GRP41), fe wnaethom hefyd archwilio GPR41 a GRP43 yng ngholon llygod colitis a chanfod bod mynegiant mRNA colonaidd GRP43 a GPR41 wedi gostwng yn sylweddol ar ôl her DSS, a gallai triniaeth BLG achub y gostyngiadau hyn yn effeithiol (Ffigur 7C a D).
Ffigur 7 Mae BLG yn cynyddu lefelau GLP-1 serwm a mynegiant mRNA Gcg, GPR41 a GRP43 y colon mewn llygod sydd wedi cael eu trin â DSS. (A) Mynegiant mRNA Gcg ym meinwe'r colon; (B) Lefel GLP-1 mewn serwm; (C) Mynegiant mRNA GPR41 ym meinwe'r colon; (D) Mynegiant mRNA GPR43 ym meinwe'r colon. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 5–6). #p < 0.05 neu ##p < 0.01 vs grŵp rheoli (Con); *p < 0.05 vs grŵp DSS.
Gan y gallai triniaeth BLG gynyddu lefelau serwm GLP-1, mynegiant mRNA Gcg y colon, a lefelau SCFA fecal mewn llygod a gafodd eu trin â DSS, fe wnaethom archwilio ymhellach asetad, propionad, a butyrad yn ogystal ag o lygod rheoli (F-Con), colitis DSS (F-Con)-DSS) a colitis a gafodd eu trin â BLG (F-BLG) ar ryddhau GLP-1 o gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd. Fel y dangosir yn Ffigur 8A, fe wnaeth celloedd epithelaidd colonaidd llygoden cynradd a gafodd eu trin â 2 mM o asid asetig, asid propionig, ac asid butyrig, yn y drefn honno, ysgogi rhyddhau GLP-1 yn sylweddol, yn gyson ag astudiaethau blaenorol.29,30 Yn yr un modd, fe wnaeth pob F-Con, F-DSS, ac F-BLG (sy'n cyfateb i 0.25 g o feces) ysgogi rhyddhau GLP-1 o gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd yn fawr. Yn nodedig, roedd faint o GLP-1 a ryddhawyd gan gelloedd epithelaidd colonaidd llygoden cynradd a gafodd eu trin â F-DSS yn llawer is na faint o F-Con. a chelloedd epithelaidd colonaidd llygoden gynradd a gafodd eu trin ag F-BLG. (Ffigur 8B). Mae'r data hyn yn awgrymu bod triniaeth BLG wedi adfer cynhyrchiad GLP-1 sy'n deillio o SCFA yn y coluddyn yn sylweddol.
Ffigur 8 Mae SCFA sy'n deillio o BLG yn ysgogi rhyddhau GLP-1 o gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd. (A) Ysgogodd asid asetig, asid propionig, ac asid butyrig ryddhau GLP-1 o gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd; (B) ysgogodd darnau fecal F-Con, F-DSS ac F-BLG gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd Swm y GLP-1 a ryddhawyd. Gosodwyd darnau bach o gelloedd epithelaidd colonaidd mewn dysglau petri gwaelod gwydr a'u trin â 2 mM o asid asetig, asid propionig, asid butyrig, ac darnau fecal F-Con, F-DSS, ac F-BLG (sy'n cyfateb i 0.25 g o feces), yn y drefn honno. 2 awr ar 37°C, 5% CO2, yn y drefn honno. Canfuwyd faint o GLP-1 a ryddhawyd o gelloedd epithelaidd colonaidd murine cynradd gan ddefnyddio ELISA. Cyflwynir data fel cymedr ± SEM (n = 3). #p < 0.05 neu ##p < 0.01 vs. gwag neu F-Con; *p < 0.05 vs. F-DSS.
Talfyriadau: Ace, asid asetig; Pro, asid propionig; fodd bynnag, asid butyrig; F-Con, dyfyniad fecal o lygod rheoli; F-DSS, dyfyniad fecal o lygod colitis; F-BLG, o'r colon wedi'i drin â BLG Detholion fecal o lygod llidiol.
Wedi'i restru gan Sefydliad Iechyd y Byd fel clefyd anodd ei atal, mae UC yn dod yn berygl byd-eang; fodd bynnag, mae dulliau effeithiol ar gyfer rhagweld, atal a thrin y clefyd yn dal yn gyfyngedig. Felly, mae angen brys i archwilio a datblygu strategaethau therapiwtig diogel ac effeithiol newydd ar gyfer UC. Mae paratoadau meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol yn opsiwn addawol oherwydd bod llawer o baratoadau meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol wedi'u dangos i fod yn effeithiol wrth drin UC ym mhoblogaeth Tsieina dros y canrifoedd, ac maent i gyd yn organigion biolegol a deunyddiau naturiol sydd i raddau helaeth yn ddiniwed i bobl ac anifeiliaid. 31,32 Nod yr astudiaeth hon oedd ceisio paratoad meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol ddiogel ac effeithiol ar gyfer trin UC ac archwilio ei fecanwaith gweithredu. Mae BLG yn fformiwla llysieuol Tsieineaidd adnabyddus a ddefnyddir i drin y ffliw. 8,33 Mae gwaith yn ein labordy ac eraill wedi dangos bod indigo, cynnyrch meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol wedi'i brosesu o'r un deunydd crai â BLG, yn arddangos effeithiolrwydd sylweddol wrth drin UC mewn bodau dynol ac anifeiliaid. 4,34 Fodd bynnag, mae effeithiau gwrth-colitis BLG a'i effeithiau Mae'r mecanwaith yn aneglur. Yn yr astudiaeth gyfredol, mae ein canlyniadau'n dangos bod BLG yn lleihau llid y coluddyn a achosir gan DSS yn effeithiol, sy'n gysylltiedig â modiwleiddio'r coluddyn. microbiota ac adfer cynhyrchiad GLP-1 sy'n deillio o'r perfedd.
Mae'n hysbys bod colitis cronig atglafychol yn cael ei nodweddu gan gyfnodau atglafychol gyda nodweddion clinigol nodweddiadol, megis colli pwysau, dolur rhydd, gwaedu rhefrol, a difrod mwcosaidd helaeth i'r colon.35 Felly, rhoddwyd colitis cronig atglafychol trwy roi tair cylch o 1.8% DSS am bum niwrnod, ac yna saith diwrnod o yfed dŵr. Fel y dangosir yn Ffigur 1B, roedd colli pwysau amrywiol a sgoriau DAI yn dangos bod colitis cronig atglafychol wedi'i ysgogi'n llwyddiannus. Dangosodd llygod yn y grŵp a gafodd driniaeth BLG adferiad ar i fyny o ddiwrnod 8, a oedd yn sylweddol wahanol i ddiwrnod 24. Gwelwyd yr un newidiadau hefyd yn y sgôr DAI, gan awgrymu gwelliant yng ngwelliant clinigol colitis. O ran anaf i'r colon a statws llidiol, gwellodd hyd y colon, difrod i feinwe'r colon, a mynegiant genynnau a chynhyrchu'r cytocinau pro-llidiol TNF-α, IL-1β, ac IL-6 ym meinwe'r colon yn fawr hefyd ar ôl triniaeth BLG. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos yn glir bod BLG yn effeithiol wrth drin colitis cronig atglafychol mewn llygod.
Sut mae BLG yn arfer ei effeithiau ffarmacolegol? Mae nifer o astudiaethau blaenorol wedi dangos bod microbiota'r perfedd yn chwarae rhan allweddol ym pathogenesis UC, ac mae therapïau sy'n seiliedig ar ficrobiomau ac wedi'u targedu at ficrobiomau wedi dod i'r amlwg fel strategaeth ddeniadol iawn ar gyfer trin UC. Yn yr astudiaeth bresennol, dangoswyd bod triniaeth BLG wedi arwain at newidiadau sylweddol yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd, gan awgrymu bod effaith amddiffynnol BLG yn erbyn colitis a achosir gan DSS yn gysylltiedig â modiwleiddio microbiota'r perfedd. Mae'r arsylwad hwn yn gyson â'r syniad bod ailraglennu homeostasis microbiota'r perfedd yn ddull pwysig o ddeall effeithiolrwydd paratoadau TCM.36,37 Yn nodedig, mae Akkermansia yn bacteriwm Gram-negatif ac anaerobig llym sy'n byw yn haen mwcws y perfedd, sy'n diraddio mwcinau, yn cynhyrchu asid propionig, yn ysgogi gwahaniaethu celloedd gobled, ac yn cynnal swyddogaeth uniondeb rhwystr y mwcosa.26 Mae data clinigol ac anifeiliaid lluosog yn awgrymu bod Akkermansia yn gysylltiedig yn fawr â mwcosa iach,38 a gweinyddiaeth lafar o Akkermansia spp. gall wella llid mwcosaidd yn sylweddol.39 Mae ein data cyfredol yn awgrymu bod nifer gymharol Akkermansia wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl triniaeth BLG. Yn ogystal, mae Prevotellaceae_UCG-001 yn bacteriwm sy'n cynhyrchu SCFA.27 Dangosodd astudiaethau lluosog fod Prevotellaceae_UCG-001 wedi'i ganfod mewn nifer gymharol isel yng ngharthion anifeiliaid â cholitis.40,41 Mae ein data presennol hefyd yn dangos y gall triniaeth BLG gynyddu nifer gymharol Prevotellaceae_UCG-001 yn sylweddol yng ngholon llygod a gafodd driniaeth DSS. Mewn cyferbyniad, mae Oscillibacter yn bacteriwm mesoffilig, llym anaerobig.42 adroddodd fod nifer gymharol Oscillibacter wedi cynyddu'n sylweddol mewn llygod UC ac roedd yn gysylltiedig yn gadarnhaol iawn â lefelau IL-6 ac IL-1β a sgoriau patholegol.43,44 Yn nodedig, gostyngodd triniaeth BLG nifer gymharol Oscillibacter yn sylweddol yng ngharthion llygod a gafodd driniaeth DSS. Yn nodedig, y bacteria hyn a newidiwyd gan BLG oedd y bacteria a oedd yn cynhyrchu'r SCFA fwyaf. Mae nifer o astudiaethau blaenorol wedi dangos effeithiau buddiol posibl SCFA ar lid y colon a diogelu cyfanrwydd epithelaidd y berfeddol.45,46 Nododd ein data presennol hefyd fod crynodiadau asetad, propionad, a butyrad SCFA mewn feces a gafodd eu trin â DSS wedi cynyddu'n fawr mewn llygod a gafodd eu trin â BLG. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn dangos yn glir y gall triniaeth BLG wella bacteria sy'n cynhyrchu SCFA a achosir gan DSS yn effeithiol mewn llygod â cholitis atglafychol cronig.
Mae GLP-1 yn incretin a gynhyrchir yn bennaf yn yr ilewm a'r colon ac mae'n chwarae rhan bwysig wrth ohirio gwagio gastrig a gostwng glwcos yn y gwaed ar ôl pryd bwyd.47 Mae tystiolaeth yn awgrymu y gall dipeptidyl peptidase (DPP)-4, agonist derbynnydd GLP-1, a nanofeddyginiaeth GLP-1 leddfu llid berfeddol yn effeithiol mewn llygod.48-51 Fel yr adroddwyd mewn astudiaethau blaenorol, roedd crynodiadau uchel o SCFA yn gysylltiedig â lefelau plasma GLP-1 mewn bodau dynol a llygod.52 Mae ein data cyfredol yn dangos, ar ôl triniaeth BLG, bod lefelau serwm GLP-1 a mynegiant mRNA Gcg wedi cynyddu'n sylweddol.Yn yr un modd, cynyddodd secretiad GLP-1 yn sylweddol mewn diwylliannau colonaidd yn dilyn ysgogiad gyda darnau fecal o lygod colitis a gafodd eu trin â BLG o'i gymharu ag ysgogiad gyda darnau fecal o lygod colitis a gafodd eu trin â DSS.Sut mae SCFA yn effeithio ar ryddhau GLP-1?Gwen Tolhurst et al. adroddwyd y gall SCFA ysgogi secretiad GLP-1 trwy GRP43 a GPR41.29 Mae ein data presennol hefyd yn dangos bod triniaeth BLG yn cynyddu mynegiant mRNA GRP43 a GPR41 yn sylweddol yng ngholon llygod sydd wedi'u trin â DSS. Mae'r data hyn yn awgrymu y gall triniaeth BLG adfer cynhyrchiad GLP-1 a hyrwyddir gan SCFA trwy actifadu GRP43 a GPR41.
Mae BLG yn gyffur hirdymor dros y cownter (OTC) yn Tsieina. Y dos uchaf a oddefir o BLG mewn llygod Kunming yw 80g/Kg, ac ni welwyd unrhyw wenwyndra acíwt.53 Ar hyn o bryd, y dos a argymhellir o BLG (heb siwgr) mewn bodau dynol yw 9-15 g/dydd (3 gwaith y dydd). Dangosodd ein hastudiaeth fod BLG ar 1g/Kg yn gwella colitis cronig atglafychol a achosir gan DSS mewn llygod. Mae'r dos hwn yn agos at y dos BLG a ddefnyddir yn glinigol. Canfu ein hastudiaeth hefyd fod ei fecanwaith gweithredu yn cael ei gyfryngu, o leiaf yn rhannol, gan newidiadau yn y microbiota perfedd, yn benodol bacteria sy'n cynhyrchu SCFA, fel Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, i adfer cynhyrchiad GLP-1 sy'n deillio o'r perfedd. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod BLG yn haeddu ystyriaeth bellach fel asiant therapiwtig posibl ar gyfer triniaeth colitis clinigol. Fodd bynnag, mae'r union fecanwaith y mae'n modiwleiddio'r microbiota perfedd drwyddo i'w gadarnhau o hyd gan lygod sydd â microbiota diffygiol a thrawsblaniadau bacteria fecal.
As, asid asetig; ond, asid butyrig; BLG, pandan; DSS, sodiwm sylffad dextran; DAI, mynegai gweithgaredd clefyd; DPP, peptidase dipeptidyl; FID, synhwyrydd ïoneiddio fflam; F-Con, rheoli Detholion fecal o lygod; F-DSS, detholion fecal o lygod colitis DSS; F-BLG, detholion fecal o lygod colitis wedi'u trin â BLG; GLP-1, peptid tebyg i glwcagon-1; Gcg, glwcagon; cromatograffaeth nwy, cromatograffaeth nwy; GRP43, derbynnydd cysylltiedig â phrotein G 43; GRP41, derbynnydd cysylltiedig â phrotein G 41; H&E, hematoxylin-eosin; HBSS, Toddiant Halen Cytbwys Hanks; OTC, OTC; PCA, dadansoddiad prif gydrannau; PCoA, dadansoddiad prif gyfesurynnau; Pro, asid propionig; SASP, sylffasalazine; SCFA, asidau brasterog cadwyn fer; meddygaeth Tsieineaidd, meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol; UC, colitis briwiol.
Cymeradwywyd yr holl brotocolau arbrofol gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Canolfan Feddygol Prifysgol Peking Shenzhen-Hong Kong ar gyfer Gwyddoniaeth a Thechnoleg (Shenzhen, Tsieina) yn unol â'r Canllawiau Sefydliadol a'r Rheoliadau Anifeiliaid (rhif moeseg A2020157).
Gwnaeth yr holl awduron gyfraniadau sylweddol at y syniad a'r dyluniad, caffael data, neu ddadansoddi a dehongli data; cymerodd ran yn y gwaith o ddrafftio'r erthygl neu adolygu cynnwys deallusol pwysig yn feirniadol; cytunodd i gyflwyno'r llawysgrif i'r cyfnodolyn cyfredol; cymeradwyodd y fersiwn i'w chyhoeddi yn y pen draw; Cyfrifol am bob agwedd ar y gwaith.
Cefnogwyd y gwaith hwn gan Sefydliad Gwyddorau Naturiol Cenedlaethol Tsieina (81560676 ac 81660479), prosiect dosbarth cyntaf Prifysgol Shenzhen (86000000210), Cronfa Pwyllgor Arloesi Gwyddoniaeth a Thechnoleg Shenzhen (JCYJ20210324093810026), a Chronfa Ymchwil Gwyddoniaeth a Thechnoleg Feddygol Talaith Guangdong (A2020157 ac A2020272), Fferyllfa Prifysgol Feddygol Guizhou Talaith Guizhou a ariannwyd gan Key Laboratory (YWZJ2020-01) ac Ysbyty Prifysgol Peking Shenzhen (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al.Potensial therapiwtig triptolid fel asiant gwrthlidiol mewn colitis arbrofol a achosir gan sodiwm sylffad dextran mewn llygod.pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Baich byd-eang IBD: o 2015 i 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, ac eraill.Alcaloidau sy'n deillio o blanhigion: addaswyr clefydau addawol mewn clefyd llidiol y coluddyn.Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, ac eraill. Mae Indigo Naturalis yn atal straen ocsideiddiol y colon ac ymatebion Th1/Th17 mewn colitis a achosir gan DSS mewn llygod. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Effeithiolrwydd a diogelwch meddygaeth lysieuol Tsieineaidd Sophora flavescens (Sophora flavescens) wrth drin colitis briwiol: tystiolaeth glinigol a mecanweithiau posibl.Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Cynhyrchion naturiol: cyffuriau effeithiol yn arbrofol ar gyfer trin clefyd llidiol y coluddyn. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Myfyrdodau ar driniaeth ategol ar gyfer colitis briwiol gyda meddygaeth draddodiadol Tsieineaidd. Imiwneiddio Alergedd Diwygiedig Clinigol. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al.Effeithiolrwydd a diogelwch gronynnau Banlangen wrth drin ffliw tymhorol: protocol astudio ar gyfer treial rheoledig ar hap.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x