Mae didoli protein yn y llwybr secretyddol yn hanfodol ar gyfer cynnal adrannu celloedd a homeostasis. Yn ogystal â didoli a gyfryngir gan gragen, mae rôl lipidau mewn didoli kinesin yn y broses o gludiant secretyddol yn gwestiwn sylfaenol hirhoedlog nad yw wedi'i ateb eto. Yma, rydym yn perfformio delweddu amser real aml-liw cydraniad uchel 3D ar yr un pryd i brofi in vivo bod proteinau sydd newydd eu syntheseiddio â glycosylphosphatidylinositol gyda moieties lipid ceramid hir iawn wedi'u clystyru a'u dosbarthu i safle ymadael net endoplasmau arbenigol, sy'n wahanol i'r hyn a ddefnyddir gan broteinau trawsbilen. Yn ogystal, rydym yn dangos bod hyd cadwyn ceramid ym mhilen y reticwlwm endoplasmig yn hanfodol ar gyfer y detholiad didoli hwn. Mae ein hastudiaeth yn darparu'r dystiolaeth uniongyrchol in vivo gyntaf i ddosbarthu cargo protein yn seiliedig ar hyd cadwyn lipid i safleoedd allforio dethol yn y llwybr secretyddol.
Mewn celloedd ewcariotig, yna caiff y proteinau a syntheseiddir yn y reticwlwm endoplasmig (ER) eu didoli yn ystod cludiant trwy'r llwybr secretyddol i'w danfon i'w cyrchfan gellog briodol (1). Yn ogystal â didoli trwy gôt, roedd yn cael ei ddyfalu ers tro y gall rhai lipidau hefyd wasanaethu fel pwyntiau ymadael dethol trwy eu clystyru i barthau pilen penodol sy'n benodol i broteinau (2-5). Fodd bynnag, mae diffyg tystiolaeth uniongyrchol in vivo o hyd i brofi'r mecanwaith posibl hwn sy'n seiliedig ar lipidau. Er mwyn datrys y broblem sylfaenol hon, fe wnaethom astudio mewn burum sut mae proteinau wedi'u hangori glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) yn cael eu hallforio'n wahanol o'r ER. Mae GPI-APs yn amrywiaeth o broteinau arwyneb celloedd sy'n gysylltiedig â lipidau (6, 7). Mae GPI-AP yn brotein secretedig sydd ynghlwm wrth daflenni allanol y bilen plasma trwy'r rhan glycolipid (angor GPI). Maent yn derbyn angorau GPI fel addasiadau ôl-gyfieithiadol ceidwadol yn lumen yr ER (8). Ar ôl ymlyniad, mae GPI-AP yn mynd trwy'r cyfarpar Golgi (5, 9) o'r ER i'r bilen plasma. Mae presenoldeb angorau GPI yn achosi i GPI-AP gael ei gludo ar wahân i broteinau a secretir gan drawsbilen (gan gynnwys proteinau pilen plasma eraill) ar hyd y llwybr secretyddol (5, 9, 10). Mewn celloedd burum, mae GPI-APs yn cael eu gwahanu oddi wrth broteinau eraill a secretir yn y reticwlwm endoplasmig, ac yna'n cael eu pecynnu i mewn i fesiglau unigryw wedi'u lapio gan gymhleth protein cot II (COPII) (6, 7). Mae penderfynyddion y broses ddosbarthu hon yn y broses allforio ER yn aneglur, ond mae'n cael ei ddyfalu y gallai'r mecanwaith hwn fod angen lipidau, yn enwedig ailfodelu strwythurol rhan lipid yr angor GPI (5, 8). Mewn burum, mae ailfodelu lipid GPI yn dechrau yn syth ar ôl i'r GPI ymlynu, ac mewn llawer o achosion, mae'n achosi i seramid rwymo i'r asid brasterog dirlawn cadwyn hir 26-carbon (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 yw'r prif seramid a gynhyrchir gan gelloedd burum hyd yn hyn. Caiff ei syntheseiddio yn yr ER a chaiff y rhan fwyaf ohono ei allforio i'r cyfarpar Golgi trwy fesiglau COPII (13). Mae allforio GPI-AP i'r ER yn benodol yn gofyn am synthesis ceramid parhaus (14, 15), ac yn ei dro, mae trosi ceramid i seramid ffosffad inositol (IPC) yn y cyfarpar Golgi yn dibynnu ar synthesis angor GPI (16). Mae astudiaethau bioffisegol gyda philenni artiffisial wedi dangos y gall ceramidau cadwyn asyl hir iawn uno i ffurfio parthau trefnus gyda phriodweddau ffisegol unigryw (17, 18). Mae'r data hyn yn arwain at y ddamcaniaeth bod ceramid C26 a GPI-AP gyda ceramid C26 yn defnyddio eu priodweddau ffisegol i uno i ranbarthau neu ranbarthau trefnus yn amgylchedd lipid pilen ER cymharol flêr. Mae'n cynnwys yn bennaf glyserolipidau byr ac annirlawn (C16:1 a C18:1) (19, 20). Bydd y rhanbarthau hyn yn canolbwyntio'n ddetholus ar safleoedd ymadael ER penodol (ERES), lle gellir cyd-gludo ceramid a GPI-AP sy'n seiliedig ar seramid i'r Golgi yn yr un fesigl COPII pwrpasol (5).
Yn yr astudiaeth hon, rydym wedi profi'r mecanwaith hwn sy'n seiliedig ar lipidau yn uniongyrchol trwy ddefnyddio microsgopeg delweddu amser real confocal uwch-gydrasiwn (SCLIM), sef techneg microsgopeg arloesol a all arsylwi proteinau wedi'u labelu'n fflwroleuol ar yr un pryd. Mae gan y delweddau tri lliw a thri dimensiwn (3D) gydraniad a chyflymder uchel iawn mewn celloedd byw (21, 22).
Yn gyntaf, fe wnaethom gymhwyso technoleg SCLIM i ddiffinio ymhellach sut y sgriniwyd GPI-AP arferol gyda grŵp ceramid C26 o broteinau a secretwyd gan drawsbilen ar ôl gadael yr ER yn S. cerevisiae. Er mwyn gwirio dosbarthiad ER, fe wnaethom ddefnyddio system enetig a all ddelweddu cargo newydd ei syntheseiddio yn uniongyrchol yn mynd i mewn i ERES in vivo (7, 23). Fel cargo, fe wnaethom ddewis GPI-AP Gas1 wedi'i seilio ar seramid C26 wedi'i labelu â phrotein fflwroleuol gwyrdd (GFP) a phrotein a secretwyd gan drawsbilen Mid2 wedi'i labelu â phrotein fflwroleuol agos-is-goch (iRFP), y mae'r ddau ohonynt yn targedu'r bilen plasma (24–26). Yn y mutant sec31-1 sy'n sensitif i dymheredd, mae'r ddau gargo hyn yn cael eu mynegi o dan hyrwyddwr y gellir ei ysgogi gan galactos a marcwr ERES cyfansoddol. Ar y tymheredd eithafol (37°C), oherwydd bod y mwtaniad sec31-1 yn effeithio ar swyddogaeth cydran cot COPII Sec31 i atal egino COPII ac allforio ER, mae cargo newydd ei syntheseiddio yn cronni yn yr ER (23). Ar ôl oeri i dymheredd isel (24°C), adferodd y celloedd mutant sec31-1 o'r ardal secretory, a dechreuwyd allforio'r cargo synthetig newydd cronedig o'r ER. Dangosodd delweddu CLIM fod y rhan fwyaf o'r Gas1-GFP a Mid2-iRFP newydd eu syntheseiddio yn dal i gronni yn ER y celloedd mutant sec31-1 ar ôl deori ar 37°C ac yna eu rhyddhau ar 24°C am 5 munud (Ffigur 1). Gan fod Mid2-iRFP wedi'i ddosbarthu ar draws pilen gyfan yr ER, a bod Gas1-GFP wedi'i grynhoi a'i gasglu yn ardal pilen ysbeidiol yr ER, mae eu dosbarthiad yn gwbl wahanol (Ffigur 1, A i C a Ffilm S1). Yn ogystal, fel y dangosir yn Ffigur 1D, nid oes gan y clwstwr Gas1-GFP Mid2-iRFP. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod proteinau GPI-AP a thrawsbilen wedi'u gwahanu i wahanol ranbarthau pilen ER yn gynnar. Mae'r clwstwr Gas1-GFP wrth ymyl ERES penodol sydd wedi'i labelu â phrotein cot COPII mCherry Sec13 (Ffigur 1, E ac F, a ffilm S1) (23).
Mae celloedd sec31-1 yn mynegi secretiadau a achosir gan galactos, ceramid cadwyn asyl hir (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, gwyrdd) a'r protein trawsbilen Mid2-iRFP (TMP, glas) a chafodd y label ERES Adeiladol hwn Sec13-mCherry (ERES, magenta) ei ddeori ar 37°C am 30 munud, ei symud i 24°C, a'i ddelweddu gan SCLIM 5 munud yn ddiweddarach. (A i C) yn dangos delwedd 2D unedig neu unffurf gynrychioliadol o awyren (A), delwedd tafluniad 2D o 10 adran-z (B) neu ddelwedd hemisffer celloedd 3D o gargo a marcwyr ERES (C). Bar graddfa 1μm (A a B). Yr uned raddfa yw 0.551μm (C). Canfuwyd Gas1-GFP mewn rhanbarthau neu glystyrau ER arwahanol, tra canfuwyd Mid2-iRFP a'i ddosbarthu ledled y bilen ER (C). (D) Mae'r graff yn dangos dwyster fflwroleuol cymharol Gas1-GFP a Mid2-iRFP yn y clwstwr Gas1-GFP ar hyd y llinell saeth wen (chwith). AU, uned fympwyol. Mae (E ac F) yn cynrychioli'r ddelwedd 3D sy'n cyfuno'r nwyddau a'r marc ERES. Canfuwyd clystyrau Gas1-GFP ger yr ERES penodol. Yr uned raddfa yw 0.551μm. (F) Mae'r saeth wen solet yn nodi'r clwstwr Gas1-GFP sy'n gysylltiedig ag ERES. Mae'r paneli canol a dde yn dangos y ddelwedd 3D estynedig wedi'i chyfuno a golygfa wedi'i gylchdroi o'r clwstwr Gas1-GFP a ddewiswyd.
Mae'r berthynas ofodol agos rhwng y clwstwr Gas1-GFP ac ERES penodol yn dangos y gall Gas1-GFP fynd i mewn i ERES dethol, sy'n wahanol i'r detholusrwydd a ddefnyddir gan Mid2-iRFP i adael yr ER. I fynd i'r afael â'r posibilrwydd hwn, fe wnaethom fesur y gymhareb ERES ar gyfer un neu ddau nwydd yn unig (Ffigur 2, A i C). Fe wnaethom ganfod bod y rhan fwyaf o ERES (70%) yn cynnwys un math o gargo yn unig. Mae delwedd waelod Ffigur 2C yn dangos dau enghraifft nodweddiadol o ERES gyda Gas1-GFP yn unig (Ffigur 1) neu Mid2-iRFP yn unig (Ffigur 2). Mewn cyferbyniad, mae tua 20% o ERES yn cynnwys dau gargo sy'n gorgyffwrdd yn yr un ardal. Canfuwyd bod rhywfaint o ERES (10%) yn cynnwys dau fath o gargo, ond roeddent wedi'u hynysu mewn ardaloedd gwahanol iawn. Felly, mae'r dadansoddiad ystadegol hwn yn dangos, ar ôl i'r ER gael ei allforio, bod GPI-AP Gas1-GFP a'r cargo trawsbilen Mid2-iRFP wedi'u rhannu'n ERES gwahanol (Ffigur 2D). Mae'r effeithlonrwydd didoli hwn yn gyson iawn â'r dadansoddiad biocemegol blaenorol (6) a'r penderfyniad morffolegol (7). Gallwn hefyd arsylwi ymddygiad y cargo cwarantîn sy'n mynd i mewn i ERES (Ffigur 2E a Ffilm S2). Mae Ffigur 2E yn dangos mai dim ond cyfran fach o Gas1-GFP (panel 3) neu Mid2-iRFP (panel 4) sy'n mynd i mewn i'r ERES o un ochr ac wedi'i gyfyngu mewn ardal ar wahân. Mae Panel 5 o Ffigur 2E yn dangos bod Gas1-GFP a Mid2-iRFP weithiau i'w cael yn yr un ERES, ond maent yn mynd i mewn o wahanol ochrau ac wedi'u crynhoi mewn rhanbarthau ar wahân a all gynrychioli gwahanol fesiglau COPII. Cadarnhawyd hefyd fod y gwahanu a'r dosbarthiad a welwyd o GPI-AP Gas1 sy'n seiliedig ar seramid C26 fel ERES dethol yn benodol oherwydd bod cargo secretiad trawsbilen arall, y protein pilen plasma wedi'i dagio â GFP Axl2 (27), yn dangos ymddygiad tebyg i Mid2-iRFP. (Llun S1 a Ffilm S3). Mae'r Axl2-GFP sydd newydd ei syntheseiddio wedi'i ddosbarthu trwy bilen yr ER fel Mid2-iRFP (Ffigur S1, A a B), ac mae wedi'i gyd-leoleiddio â Mid2-iRFP yn y rhan fwyaf o ERES (Ffigur S1, B i D). Mae paneli 1 a 2 o Ffigur 1. S1C yn dangos dau enghraifft nodweddiadol o ERES lle mae dau gargo trawsbilen yn gorgyffwrdd. Yn yr achosion hyn, mae'r ddau nwydd yn mynd i mewn i ERES gyda'i gilydd (Ffigur S1E, Panel 3 a Ffilm S3).
Gosodwyd y celloedd sec31-1 sy'n mynegi secretiadau y gellir eu hysgogi gan galactos, Gas1-GFP (GPI-AP, gwyrdd) a Mid2-iRFP (TMP, glas) a labelu ERES cyfansoddol Sec13-mCherry (ERES, magenta) ar 37. Ar ôl deori am 30 munud ar °C, symudwch i 24 °C i ryddhau'r bloc secretiad, a chymerwch ddelwedd gyda SCLIM ar ôl 20 munud. (A i C) Delweddau taflunio 2D cynrychioliadol (A; bar graddfa, 1μm) neu ddelweddau hemisffer celloedd 3D (B a C; uned raddfa, 0.456μm) o'r cargo a 10 adran-z wedi'u marcio ag ERES. Mae'r panel isaf yn (B) a'r panel yn (C) yn arddangos delweddau wedi'u prosesu i arddangos dim ond y nwyddau sy'n bresennol yn ERES (magenta) [Gas1-GFP (llwyd) a Mid2-iRFP (glas golau)]. (C) Saeth agored: Dim ond un darn o gargo (1 i 4) y mae ERES yn ei gario. Saeth lwyd: Mae ERES yn cynnwys cargo wedi'i wahanu (5). Saeth wen solet: Mae ERES yn cynnwys cargo wedi'i gydleoli. Isod: Dim ond Gas1-GFP (1) neu Mid2-iRFP (2) sydd yn yr ERES sengl a ddewiswyd. Bar graddfa, 100 nm. (D) Mesur y ffotomicrograff a ddisgrifir yn (C). Y ganran gyfartalog o ERES sy'n cynnwys un cargo yn unig (Gas1-GFP neu Mid2-iRFP), cargo wedi'i wahanu a cargo sy'n gorgyffwrdd. Mewn tri arbrawf annibynnol, n=432 mewn 54 cell. Bar gwall = SD. Prawf-t heb ei baru dwy gynffon. *** P = 0.0002. (E) Delwedd 3D o ERES a ddewiswyd o gargo wedi'i gwarantîn wedi'i farcio â (C). Mae Gas1-GFP (gwyrdd) (3) neu Mid2-iRFP (glas) (4) yn mynd i mewn i ERES (magenta) o un ochr ac mae wedi'i gyfyngu i ardal fach o fewn ERES. Weithiau, mae'r ddau fath o gargo yn mynd i mewn i'r un ERES (5) o'r un ochr ac wedi'u cyfyngu i ardal ynysig o fewn yr ERES. Bar graddfa, 100 nm.
Nesaf, fe wnaethom brofi rhagdybiaeth bod y ceramid cadwyn asyl hir (C26) sy'n bresennol ym mhilen yr ER yn gyrru'r clystyru a'r didoli penodol o Gas1 i ERES dethol. I'r perwyl hwn, fe wnaethom ddefnyddio straen burum wedi'i addasu GhLag1, lle cafodd y ddau synthase ceramid endogenaidd Lag1 a Lac1 eu disodli gan GhLag1 (homolog Lag1 cotwm), gan arwain at straen burum gyda straen Ceramid pilen gell fyrrach na'r math gwyllt (Ffigur 3A) (28). Dangosodd dadansoddiad sbectrometreg màs (MS) mewn straenau math gwyllt, fod 95% o gyfanswm y ceramid yn seramid cadwyn hir iawn (C26), tra yn GhLag1, bod 85% o'r ceramid yn hir iawn (C18 a C16), dim ond 2% o'r ceramid sy'n seramid cadwyn hir iawn (C26). Er mai ceramidau C18 a C16 yw'r prif seramidau a ganfuwyd ym mhilen GhLag1 hyd yn hyn, cadarnhaodd dadansoddiad MS hefyd fod angor GPI Gas1-GFP a fynegir yn y straen GhLag1 yn cynnwys ceramid C26, sy'n gymharol â lipidau math gwyllt. Mae'r ansawdd yr un fath (Ffig. 3A) (26). Felly, mae hyn yn golygu bod yr ensym ailfodelu ceramid Cwh43 yn ddetholus iawn ar gyfer ceramid C26, fel y dangosir yn Ffigur 26, mae'n ymgorffori'r angor GPI o swm bach o ceramid C26 yn y straen GhLag1 yn ffafriol. S2 (29). Serch hynny, dim ond ceramid C18-C16 sydd ym mhilen gell GhLag1 yn y bôn, tra bod gan Gas1-GFP seramid C26 o hyd. Mae'r ffaith hon yn gwneud y straen hwn yn offeryn delfrydol i ddatrys problem hyd cadwyn asyl ceramid pilen yn yr ER yn benodol. Rôl ddamcaniaethol dosbarth a didoli. Yna, fe wnaethom astudio gallu C26 Gas1-GFP i gronni mewn clystyrau yn GhLag1 gydag alel mutant sensitif i dymheredd o sec31-1 trwy ficrosgopeg fflwroleuedd confensiynol, lle dim ond y gadwyn hir (C18-C16) sy'n bodoli yn y bilen ER Ceramid (Ffig. 3). Gwelsom fod y rhan fwyaf o Gas1-GFP wedi'i grynhoi mewn clystyrau yn sec31-1, tra nad oedd Gas1-GFP yn sec31-1 GhLag1 gyda philen ER ceramid hir (C18-C16) wedi'i glystyru a'i ddosbarthu yn bennaf yn y bilen ER gyfan. I fod yn fanwl gywir, oherwydd bod clystyru yn seiliedig ar seramid C26 yn gysylltiedig yn agos ag ERES penodol (Ffigur 1), fe wnaethom ymchwilio nesaf a allai'r broses hon hefyd gynnwys swyddogaeth y mecanwaith protein allforio ER. Mae GPI-AP yn defnyddio system COPII arbennig ar gyfer allforio ER, sy'n cael ei rheoleiddio'n weithredol gan ailfodelu strwythurol Ted1 o ran glycan angor GPI (30, 31). Yna caiff y GPI-glycan ailgyfunol ei adnabod gan y cymhlyg p24 derbynnydd cargo trawsbilen, sydd yn ei dro yn recriwtio Lst1 yn ddetholus, sef isoffurf penodol o'r is-uned rhwymo cargo COPII fawr Sec24, gan ffurfio COPII sy'n llawn GPI-AP. Mae angen fesiglau (31-33). Felly, fe wnaethom adeiladu mwtant dwbl a gyfunodd ddileu'r proteinau sengl hyn (y gydran gymhlyg p24 Emp24, yr ensym ailfodelu GPI-glycan Ted1 a'r is-uned COPII benodol Lst1) gyda'r straen mwtant sec31-1, a'u hastudio. A yw'n bosibl ffurfio GFP clwstwr Gas1 (Ffigur 3). Gwelsom, yn sec31-1emp24Δ a sec31-1ted1Δ, fod Gas1-GFP wedi'i ddad-glystyru'n bennaf ac wedi'i ddosbarthu ledled y bilen ER, fel y gwelwyd yn flaenorol yn sec31-1 GhLag1, tra yn sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Fel sec31-1. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos, yn ogystal â phresenoldeb ceramid C26 ym mhilen yr ER, fod angen i glystyru Gas1-GFP rwymo i'r cymhlyg p24 hefyd, ac nad oes angen recriwtio Lst1 penodol. Yna, archwiliwyd y posibilrwydd y gall hyd cadwyn ceramid ym mhilen yr ER reoleiddio rhwymo Gas1-GFP i p24. Fodd bynnag, gwelsom nad yw presenoldeb ceramid C18-C16 yn y bilen yn effeithio ar y GPI-glycans a ailadeiladwyd gan y cymhlyg p24 (Ffigurau S3 ac S4, A a B) nac ar rwymo i GPI-AP ac allforio GPI-AP. Recriwtio isdeip COPII Lst1 (Ffigur S4C). Felly, nid yw clystyru sy'n ddibynnol ar seramid C26 yn gofyn am ryngweithiadau protein â gwahanol fecanweithiau protein allforio ER, ond mae'n cefnogi mecanwaith didoli amgen sy'n cael ei yrru gan hyd lipid. Yna, dadansoddwyd a yw hyd cadwyn asyl y ceramid ym mhilen yr ER yn bwysig ar gyfer dosbarthu Gas1-GFP yn effeithiol fel ERES dethol. Gan fod Gas1 yn y straen GhLag1 gyda ceramid cadwyn fer yn gadael yr ER ac yn mynd i mewn i'r bilen plasma (Ffigur S5), credwn, os yw'r didoli'n cael ei yrru gan hyd y gadwyn asyl ceramid, y gellir ailgyfeirio a chroesi'r Gas1 yn y straen GhLag1. Nwyddau ERES gyda'r un bilen.
(A) Mae pilen gell GhLag1 yn cynnwys ceramidau C18-C16 byrrach yn bennaf, tra bod gan angor GPI Gas1-GFP yr un C26 IPC â chelloedd math gwyllt o hyd. Uchod: dadansoddiad hyd cadwyn asyl o seramid ym mhilen gell straeniau math gwyllt (Wt) a GhLag1p trwy sbectrometreg màs (MS). Mae'r data'n cynrychioli canran cyfanswm y ceramid. Cyfartaledd tair arbrawf annibynnol. Bar gwall = SD. Prawf-t heb ei baru dau gynffon. **** P <0.0001. Panel gwaelod: Dadansoddiad MS o hyd cadwyn asyl yr IPC sy'n bresennol yn angor GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) a fynegir yn y straeniau math gwyllt a GhLag1p. Mae'r data'n cynrychioli canran cyfanswm y signal IPC. Cyfartaledd pum arbrawf annibynnol. Bar gwall = SD. Prawf-t heb ei baru dau gynffon. ns, ddim yn bwysig. P = 0.9134. (B) Cafodd micrograffau fflwroleuedd o gelloedd sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ a sec31-1lst1Δ sy'n mynegi Gas1-GFP a achosir gan galactos eu magu ar 37°C am 30 munud a'u trosglwyddo i lawr i Perfformiwch ficrosgopeg fflwroleuedd arferol ar ôl 24°C. Saeth wen: Clwstwr ER Gas1-GFP. Saeth agored: Mae Gas1-GFP heb glwstwr wedi'i ddosbarthu ar y bilen ER gyfan, gan ddangos y staenio cylch niwclear nodweddiadol ER. Bar graddfa, 5μm. (C) Mesur y ffotomicrograff a ddisgrifir yn (B). Y ganran gyfartalog o gelloedd â strwythur atalnod Gas1-GFP. Mewn tri arbrawf annibynnol, n≥300 o gelloedd. Bar gwall = SD. Prawf-t heb ei baru dau gynffon. **** P <0.0001.
I ddatrys y broblem hon yn uniongyrchol, fe wnaethom ni ddelweddu SCLIM o Gas1-GFP a Mid2-iRFP yn GhLag1 gyda'r alel mutant sy'n sensitif i dymheredd sec31-1 (Ffigur 4 a Ffilm S4). Ar ôl i'r ER gael ei gadw ar 37°C ac yna ei ryddhau ar 24°C, ni chafodd y rhan fwyaf o'r Gas1-GFP newydd ei syntheseiddio ei glystyru a'i ddosbarthu ledled pilen yr ER, fel y gwelwyd gan ficrosgopau confensiynol (Ffigur 4, A a B). Yn ogystal, mae canran fawr o ERES (67%) yn cynnwys dau fath o gargo wedi'u cydleoli ynddo (Ffigur 4D). Mae Paneli 1 a 2 o Ffigur 4C yn dangos dau enghraifft nodweddiadol o ERES gyda Gas1-GFP a Mid2-GFP yn gorgyffwrdd. Yn ogystal, cafodd y ddau nwydd eu recriwtio i'r un ERES (Ffigur 4E, panel 3 a ffilm S4). Felly, mae ein canlyniadau'n dangos bod hyd y gadwyn asyl ceramid yn y bilen ER yn ffactor pwysig o agregu a dosbarthu protein ER.
Celloedd Sec31-1 GhLag1 sy'n mynegi secretiadau a achosir gan galactos, Gas1-GFP (GPI-AP, gwyrdd) a Mid2-iRFP (TMP, glas) a Sec13-mCherry (ERES, magenta) wedi'i labelu ag ERES cyfansoddol Deorwch ar 37°C. Parhewch am 30 munud, gostyngwch i 24°C i ryddhau secretiadau, a chymerwch ddelwedd gyda SCLIM ar ôl 20 munud. (A i C) Delweddau taflunio 2D cynrychioliadol (A; bar graddfa, 1μm) neu ddelweddau hemisffer celloedd 3D (B a C; uned raddfa, 0.45μm) o'r 10 adran z wedi'u marcio gan gargo ac ERES. Mae'r panel isaf yn (B) a'r panel yn (C) yn arddangos delweddau wedi'u prosesu i arddangos dim ond y nwyddau sy'n bresennol yn ERES (magenta) [Gas1-GFP (llwyd) a Mid2-iRFP (glas golau)]. (C) Saeth wedi'i llenwi'n wen: ERES, nwyddau'n gorgyffwrdd. Saeth agored: Dim ond un eitem sydd yn ERES. Panel isaf: Mae gan yr ERES a ddewiswyd nwyddau sy'n gorgyffwrdd (1 a 2) wedi'u marcio yn (C). Bar graddfa, 100 nm. (D) Mesur y ffotomicrograff a ddisgrifir yn (C). Yn unedau GhLag1 sec31-1 ac sec31-1, dim ond un cargo (Gas1-GFP neu Mid2-iRFP) sydd wedi'i gynnwys, a'r ganran gyfartalog o ERES ar gyfer cargo ynysig a chargo sy'n gorgyffwrdd. Mewn tri arbrawf annibynnol, n = 432 mewn 54 cell (sec31-1) ac n = 430 mewn 47 cell (sec31-1 GhLag1). Bar gwall = SD. Prawf-t heb ei baru dwy gynffon. *** P = 0.0002 (sec31-1) a ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Delwedd 3D o ERES a ddewiswyd gyda chargo sy'n gorgyffwrdd (3) wedi'i farcio yn (C). Mae Gas1-GFP (gwyrdd) a Mid2-iRFP (glas) yn agosáu at ERES (magenta) o'r un ochr ac yn aros yn yr un ardal gyfyngedig ERES. Bar graddfa, 100 nm.
Mae'r astudiaeth hon yn darparu tystiolaeth uniongyrchol in vivo bod cargo protein sy'n seiliedig ar lipidau yn cael eu dosbarthu i safleoedd allforio dethol yn y llwybr secretyddol, ac yn datgelu pwysigrwydd hyd cadwyn asyl ar gyfer detholusrwydd dosbarthu. Gan ddefnyddio techneg microsgopeg bwerus ac arloesol o'r enw SCLIM, fe wnaethom ddangos y Gas1-GFP newydd ei syntheseiddio (GPI-AP pilen plasma fawr gyda rhan lipid ceramid cadwyn asyl (C26) hir iawn) mewn burum). Mae'r rhanbarthau sydd wedi'u clystyru mewn ERs arwahanol yn gysylltiedig ag ERES penodol, tra bod proteinau a secretir trawsbilen wedi'u dosbarthu ledled pilen yr ER (Ffigur 1). Yn ogystal, mae'r ddau fath hyn o nwyddau yn mynd i mewn i ERES gwahanol yn ddetholus (Ffigur 2). Mae hyd cadwyn asyl y ceramid cellog yn y bilen yn cael ei leihau o C26 i C18-C16, mae'r clwstwr Gas1-GFP yn cael ei amharu i'r rhanbarth ER arwahanol, ac mae Gas1-GFP yn cael ei ailgyfeirio i adael yr ER gyda'r protein trawsbilen trwy'r un ERES (Ffigur 3 a Ffigur 3). 4).
Er bod GPI-AP yn defnyddio mecanwaith protein arbenigol i adael yr ER, gwelsom nad yw gwahanu sy'n ddibynnol ar seramid C26 yn dibynnu ar ryngweithiadau protein gwahaniaethol a all arwain at arbenigo yn ERES (Ffigurau S4 ac S5). Yn lle hynny, mae ein canfyddiadau'n cefnogi mecanwaith dosbarthu amgen sy'n cael ei yrru gan glystyru protein sy'n seiliedig ar lipidau ac eithrio cargo eraill wedi hynny. Mae ein harsylwadau'n dangos bod y rhanbarth neu'r clwstwr Gas1-GFP sy'n gysylltiedig ag ERES penodol yn brin o'r protein secretedig trawsbilen Mid2-iRFP, sy'n dangos y bydd y clwstwr GPI-AP sy'n ddibynnol ar seramid C26 yn hwyluso eu mynediad i'r ERES perthnasol, ac ar yr un pryd, yn eithrio trawsbilen. Mae'r secretiadau'n mynd i mewn i'r ERES penodol hwn (Ffigurau 1 a 2). Mewn cyferbyniad, nid yw presenoldeb ceramidau C18-C16 ym mhilen yr ER yn achosi i GPI-AP ffurfio rhanbarthau na chlystyrau, felly nid ydynt yn eithrio nac yn disodli proteinau secretedig trawsbilen i'r un ERES (Ffigurau 3 a 4). Felly, rydym yn cynnig bod ceramid C26 yn sbarduno gwahanu a dosbarthu trwy hwyluso clystyru proteinau sy'n gysylltiedig ag ERES penodol.
Sut i gyflawni'r clystyru hwn sy'n ddibynnol ar seramid C26 i mewn i ardal ER benodol? Gall tueddiad seramid pilen i wahanu'n ochrol achosi i GPI-AP a seramid C26 ffurfio lipidau bach a threfnus ar unwaith yn amgylchedd lipid mwy afreolaidd pilen yr ER sy'n cynnwys glyserolipidau byrrach ac annirlawn. Clystyrau o ansawdd (17, 18). Gellir uno'r clystyrau bach dros dro hyn ymhellach i glystyrau mwy a mwy sefydlog ar ôl rhwymo i'r cymhlyg p24 (34). Yn gyson â hyn, dangoswyd bod angen i C26 Gas1-GFP ryngweithio â'r cymhlyg p24 i ffurfio clystyrau gweladwy mwy (Ffigur 3). Mae'r cymhlyg p24 yn oligomer heterosygaidd sy'n cynnwys pedwar protein trawsbilen p24 gwahanol mewn burum (35), sy'n darparu rhwymo aml-falent, a all arwain at groesgysylltu clystyrau GPI-AP bach, a thrwy hynny gynhyrchu clwstwr Sefydlog mwy (34). Gall y rhyngweithio rhwng ectodomainau protein GPI-APs hefyd gyfrannu at eu crynhoi, fel y dangosir yn ystod eu cludiant Golgi mewn celloedd epithelaidd polareiddiedig mamaliaid (36). Fodd bynnag, pan fydd ceramid C18-C16 yn bresennol yn y bilen ER, pan fydd y cymhlyg p24 yn rhwymo i Gas1-GFP, ni fydd clystyrau mawr ar wahân yn cael eu ffurfio. Gall y mecanwaith sylfaenol ddibynnu ar briodweddau ffisegol a chemegol penodol y ceramid cadwyn asyl hir. Mae astudiaethau bioffisegol o bilenni artiffisial yn dangos, er y gall ceramidau cadwyn asyl hir (C24) a byr (C18-C16) achosi gwahanu cyfnodau, dim ond ceramidau cadwyn asyl hir (C24) all hyrwyddo Crymedd uchel a phlygu ffilm i ail-lunio'r ffilm. Trwy gyfeirio cydfuddiannol (17, 37, 38). Dangoswyd bod helics trawsbilen TMED2, homolog dynol Emp24, yn rhyngweithio'n ddetholus â sffingomyelin sy'n seiliedig ar seramid C18 yn y lobulau cytoplasmig (39). Gan ddefnyddio efelychiadau deinameg moleciwlaidd (MD), gwelsom fod ceramidau C18 a C26 yn cronni o amgylch lobulau cytoplasmig helics trawsbilen Emp24, ac mae ganddynt ddewisiadau tebyg (Ffigur S6). Mae'n werth nodi bod hyn yn dangos y gall helics trawsbilen Emp24 arwain at ddosbarthiad anghymesur o lipidau yn y bilen. Mae hwn yn ganlyniad diweddar yn seiliedig ar gelloedd mamalaidd. Mae efelychiadau MD tebyg hefyd yn dangos presenoldeb lipidau ether (40). Felly, rydym yn dyfalu bod ceramid C26 yn y ddau lobulau o ER26 wedi'i gyfoethogi'n lleol. Pan fydd GPI-AP yn y lobulau luminal yn rhwymo'n uniongyrchol i p24 amlfalent a chronni ceramid C26 o amgylch p24 yn y lobulau cytoplasmig, gall hyrwyddo'r agregu Protein cysylltiedig a chynhyrchir crymedd y bilen trwy'r bysedd (41), gan achosi i GPI-AP wahanu i ranbarthau arwahanol ger ERES, sydd hefyd yn ffafrio'r rhanbarthau crwm iawn o bilen ER (42). Cefnogodd adroddiadau blaenorol y mecanwaith arfaethedig (43, 44). Mae rhwymo amlfalent oligolectinau, pathogenau neu wrthgyrff i glycosphingolipidau (GSL) sy'n seiliedig ar seramid ar y bilen plasma yn sbarduno agregu GSL mawr, yn gwella gwahanu cyfnodau ac yn achosi anffurfiad a mewnosod y bilen (44). Iwabuchi ac ati (43) Canfuwyd, ym mhresenoldeb cadwyni asyl hir (C24) ond nid byr (C16), fod y ligand amlfalent wedi'i rwymo i lactosylceramid GSL wedi achosi ffurfio clystyrau mawr a mewnlifiad pilen, ac mae trawsgludiad signal cytoplasm a gyfryngir gan Lyn ar y dail wedi'i ryngweithio gan gadwyni asyl mewn niwtroffiliau cyplyd.
Mewn celloedd epithelaidd polareiddiedig mamaliaid, mae crynodiad y rhwydwaith gwrth-Golgi (TGN) i lefel y bilen plasma apical yn rheoli gwahanu a didoli GPI-AP (10, 45). Mae'r crynhoad hwn yn cael ei yrru gan oligomerization GPI-AP (36), ond gall hefyd ddibynnu ar hyd y gadwyn ceramid a welwn mewn burum. Er bod gan GPI-AP mamaliaid angor sy'n seiliedig ar lipid ether, ac mae ei strwythur cemegol yn wahanol iawn i'r ceramid cadwyn asyl hir iawn, canfu astudiaeth ddiweddar fod gan y ddau lipid briodweddau ffisegol a chemegol tebyg yn esblygiadol a swyddogaeth (40). Felly, gall y rhan lipid ether mewn celloedd mamaliaid fod yn debyg i'r ceramid C26 mewn burum, a'i rôl yw cysylltu â'r ceramid cadwyn hir yn y bilen i hyrwyddo crynhoad a didoli GPI-AP. Er bod angen profi'r posibilrwydd hwn yn uniongyrchol o hyd, mae canfyddiadau blaenorol yn cefnogi nad yw cludo'r ceramid cadwyn asyl hir i gorff Golgi yn cael ei wneud gan broteinau trosglwyddo cytoplasmig, ond yn dibynnu ar synthesis angorau GPI fel burum. Felly, mae'n ymddangos bod y mecanwaith ceidwadol esblygiadol yn gallu cyd-gludo ceramid cadwyn asyl hir iawn a GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) yn ddetholus yn yr un fesigl cludo.
Mewn systemau celloedd epithelaidd polaraidd burum a mamaliaid, mae agregu a gwahanu GPI-AP oddi wrth broteinau pilen plasma eraill i gyd yn digwydd cyn cyrraedd wyneb y gell. Canfu Paladino et al. (48) ar y TGN o gelloedd epithelaidd polaraidd mamaliaid, nid yn unig y mae clwstrio GPI-AP yn angenrheidiol ar gyfer dosbarthu dethol GPI-APs i'r bilen plasma apical, ond mae hefyd yn rheoleiddio trefniadaeth clwstrio GPI-APs a'i weithgaredd biolegol. Arwyneb celloedd. Mewn burum, dangosodd yr astudiaeth hon y gall y clwstwr GPI-AP sy'n ddibynnol ar seramid C26 ar yr ER reoleiddio trefniadaeth clwstwr a gweithgaredd swyddogaethol GPI-AP ar y bilen plasma (24, 49). Yn gyson â'r model hwn, mae celloedd GhLag1 yn alergaidd i atalyddion GPI neu gyffuriau sy'n effeithio ar gyfanrwydd waliau celloedd (28), ac mae'r angen am glystyrau Gas1-GFP swyddogaethol (49) o'r ceramid blaen a ragwelir wrth baru celloedd burum yn dynodi G​​​ Canlyniadau ffisiolegol posibl celloedd hLag1. Gwall GPI-AP. Fodd bynnag, bydd profion pellach a yw trefniadaeth swyddogaethol arwyneb y gell wedi'i rhaglennu o'r ER trwy ddull didoli yn seiliedig ar hyd lipid yn destun ein hymchwil yn y dyfodol.
Rhestrir y straeniau Saccharomyces cerevisiae a ddefnyddiwyd yn y gwaith hwn yn Nhabl S1. Adeiladwyd y straeniau MMY1583 a MMY1635 o SCLIM ar gyfer delweddu celloedd byw yng nghefndir W303. Adeiladwyd y straeniau hyn sy'n mynegi Sec13-mCherry gyda thag protein fflwroleuol gan ddefnyddio dull seiliedig ar adwaith cadwyn polymerase (PCR) gyda plasmid pFA6a fel templed (23). Adeiladwyd y straen sy'n mynegi Mid2-iRFP wedi'i labelu â phrotein fflwroleuol o dan reolaeth hyrwyddwr GAL1 fel a ganlyn. Mwyhadur PCR o ddilyniant iRFP-KanMx o fector pKTiRFP-KAN (rhodd gan E. O'Shea, rhif plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; dynodwr adnoddau ymchwil (RRID): Addgene_64687) A'i fewnosod i derfynfa-C Mid2 mewndarddol. Ar ôl i ddilyniant genom Mid2-iRFP gael ei fwyhau a'i glonio i hyrwyddwr GAL1, cafodd ei integreiddio i safle Not I-Sac I y plasmid integreiddio pRS306. Cafodd y plasmid pRGS7 canlyniadol ei linoleiddio gyda Pst I i integreiddio i'r locws URA3.
Mynegir y genyn asio Gas1-GFP o dan reolaeth hyrwyddwr GAL1 yn y plasmid centromere (CEN), sydd wedi'i adeiladu fel a ganlyn. Cafodd dilyniant Gas1-GFP ei fwyhau gan PCR o'r plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (rhodd gan L. Popolo) a'i glonio i safle Xma I–Xho I y plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (rhodd gan C). Miller; Rhif plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Enwyd y plasmid canlyniadol yn pRGS6. Mynegir y genyn asio Axl2-GFP hefyd o dan reolaeth hyrwyddwr GAL1 y fector pBEVY-GL LEU2, ac mae ei adeiladwaith fel a ganlyn. Cafodd dilyniant Axl2-GFP ei fwyhau o blasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) gan PCR, a'i glonio i safle Bam HI-Pst I y fector pBEVY-GL LEU2. Enwyd y plasmid canlyniadol yn pRGS12. Rhestrir dilyniant yr oligoniwcleotidau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl S2.
Ychwanegwyd at y straen gyda 0.2% adenin a 2% glwcos [YP-dextros (YPD)], cyfrwng protein p (YP) echdynniad burum cyfoethog mewn raffinos [YP-raffinos] (1% echdynniad burum a 2% protein ept). (YPR)] neu 2% galactos [YP-galactos (YPG)] fel ffynhonnell carbon, neu mewn cyfrwng lleiafswm synthetig (0.15% sylfaen nitrogen burum a 0.5% sylffad amoniwm) i ategu'r asidau amino a'r basau priodol sydd eu hangen ar gyfer maeth, ac yn cynnwys 2% glwcos (cyfrwng lleiafswm glwcos synthetig) neu 2% galactos (cyfrwng lleiafswm galactos synthetig) fel ffynhonnell carbon.
Ar gyfer delweddu amser real, tyfwyd celloedd mwtant sec31-1 sy'n sensitif i dymheredd ac yn mynegi'r adeiladwaith o dan hyrwyddwr GAL1 mewn cyfrwng YPR ar 24°C dros nos i gyfnod canol log. Ar ôl eu sefydlu yn YPG ar 24°C am 1 awr, cafodd y celloedd eu magu mewn SG ar 37°C am 30 munud, ac yna eu trosglwyddo i 24°C i'w rhyddhau o'r bloc secretiad. Defnyddiwyd Concanavalin A i osod y celloedd ar sleid wydr a'u delweddu gan SCLIM. Mae SCLIM yn gyfuniad o ficrosgop fflwroleuedd gwrthdro Olympus IX-71 a lens olew agorfa rifiadol UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), sganiwr confocal disg cylchdroi cyflymder uchel a chymhareb signal-i-sŵn uchel (Yokogawa Electric), sbectromedr wedi'i deilwra, ac oeri wedi'i deilwra. Gall dwysáu delwedd y system (Hamamatsu Photonics) ddarparu system lens chwyddedig gyda chwyddiad terfynol o ×266.7 a chamera dyfais gyplu gwefr sy'n lluosi electronau (Hamamatsu Photonics) (21). Caiff delweddau eu caffael gan feddalwedd wedi'i deilwra (Yokogawa Electric). Ar gyfer delweddau 3D, fe wnaethom ddefnyddio gweithredydd piezoelectrig wedi'i deilwra i ddirgrynu'r lens amcan yn fertigol, a chasglu'r rhannau optegol 100 nm ar wahân mewn pentwr. Caiff y ddelwedd Z-stack ei throsi'n ddata voxel 3D, a defnyddir y swyddogaeth lledaeniad pwynt damcaniaethol a ddefnyddir ar gyfer y microsgop confocal disg cylchdroi ar gyfer prosesu dadgydbwyso gan feddalwedd Volocity (PerkinElmer). Drwy ddefnyddio meddalwedd Volocity i drothwyo'n awtomatig ar gyfer dadansoddiad cydleoli, mesurwyd ERES gan gynnwys cargo. Perfformiwyd dadansoddiad sgan llinell gan ddefnyddio meddalwedd MetaMorph (Molecular Devices).
Defnyddiwch feddalwedd GraphPad Prism i bennu arwyddocâd ystadegol. Ar gyfer prawf-t dwy-gynffon Myfyriwr a'r prawf dadansoddi amrywiant unffordd cyffredin (ANOVA), ystyrir bod gwahaniaethau rhwng grwpiau yn cael effaith sylweddol ar P <0.05 (*).
Ar gyfer microsgopeg fflwroleuol Gas1-GFP, tyfwyd y celloedd cyfnod log dros nos yn YPD a'u casglu trwy allgyrchu, eu golchi ddwywaith â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad, a'u deori ar rew am o leiaf 15 munud, ac yna eu symud ymlaen o dan y microsgop fel y disgrifiwyd yn flaenorol Gwiriad (24). Defnyddiwyd y microsgop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 olew PH3 CS) wedi'i gyfarparu â lens amcan, hidlydd L5 (GFP), camera Hamamatsu a meddalwedd Application Suite X (LAS X) ar gyfer caffael.
Cafodd y samplau eu dadnatureiddio gyda byffer sampl SDS ar 65°C am 10 munud, ac yna eu gwahanu gan electrofforesis gel SDS-polyacrylamid (PAGE). Ar gyfer dadansoddiad imiwnoblotio, llwythwyd 10 μl o sampl fesul lôn. Gwrthgorff cynradd: Defnyddiwch polyclonal gwrth-Gas1 cwningen ar wanhad o 1:3000, polyclonal gwrth-Emp24 cwningen ar wanhad o 1:500, a polyclonal gwrth-GFP cwningen (rhodd gan H. Riezman) ar wanhad o 1:3000. Defnyddiwyd yr gwrthgorff monoclonal gwrth-Pgk1 llygoden ar wanhad o 1:5000 (rhodd gan J. de la Cruz). Gwrthgorff eilaidd: Defnyddiwyd imiwnoglobulin gafr gwrth-gwningen G (IgG) cysylltiedig â marchruddygl perocsidase (HRP) ar wanhad o 1:3000 (Pierce). Defnyddiwyd IgG gafr gwrth-lygoden wedi'i gyfuno â HRP ar wanhad o 1:3000 (Pierce). Arsylwyd y parth ymateb imiwnedd gan ddefnyddio dull cemiluminescence adweithydd SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Fel y disgrifiwyd yn (31), perfformiwyd arbrawf imiwno-ddyfodiad naturiol ar y ffracsiwn ER wedi'i gyfoethogi. Yn gryno, golchwch gelloedd burum gyda byffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fflworid phenylmethylsulfonyl a chymysgedd atalydd proteas) ar 600 nm (OD600) ar ddwysedd optegol 100 ddwywaith. Fe'i torrwyd â gleiniau gwydr, ac yna tynnwyd y malurion celloedd a'r gleiniau gwydr trwy allgyrchu. Yna cafodd yr uwchnofiant ei allgyrchu ar 17,000 g am 15 munud ar 4°C. Ail-ataliwyd y belen yn TNE ac ychwanegwyd saponin digitalis i grynodiad terfynol o 1%. Deorwyd yr ataliad am 1 awr gyda chylchdro ar 4°C, ac yna tynnwyd y cydrannau anhydawdd trwy allgyrchu ar 13,000 g ar 4°C am 60 munud. Ar gyfer imiwno-ddyfodiad Gas1-GFP, yn gyntaf cyn-ddeori'r sampl gyda gleiniau agaros gwag (ChromoTek) ar 4°C am 1 awr, ac yna deori gyda GFP-Trap_A (ChromoTek) ar 4°C am 3 awr. Golchwyd y gleiniau imiwno-ddyfodiad bum gwaith gyda TNE yn cynnwys 0.2% digoxigenin, eu helutio gyda byffer sampl SDS, eu gwahanu ar SDS-PAGE, a'u dadansoddi trwy imiwnoblotio.
Fel y disgrifiwyd yn (31), perfformiwyd penderfyniad croesgysylltu ar y ffracsiwn ER cyfoethog. Yn gryno, cafodd y ffracsiwn ER cyfoethog ei ddeori gyda 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionad) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, UDA; 20°C, 20 munud). Diffoddwyd yr adwaith croesgysylltu trwy ychwanegu glysin (crynodiad terfynol 50 mM, 5 munud, 20°C).
Fel y disgrifiwyd yn flaenorol (50), perfformiwyd dadansoddiad MS o seramid mewn straenau gwyllt a GhLag1. Yn gryno, tyfwyd celloedd i gyfnod esbonyddol (3 i 4 uned OD600/ml) yn YPD ar 30°C, a chasglwyd 25 × 107 o gelloedd. Caiff eu metaboledd ei ddiffodd ag asid trichloroacetig. Defnyddiwch doddydd echdynnu [ethanol, dŵr, ether, pyridin a 4.2 N amoniwm hydrocsid (15:15:5:1:0.018 v/v)] ac 1.2 nmol o seramid safonol mewnol C17 (860517, ansawdd lipid pegynol Avanti)). Defnyddiwch adweithydd monomethylamin [methanol, dŵr, n-butanol a hydoddiant methylamin (4:3:1:5 v/v)] i berfformio hydrolysis alcalïaidd ysgafn o'r dyfyniad, ac yna defnyddiwch n-butanol dirlawn â dŵr i ddadhalen. Yn olaf, cafodd y dyfyniad ei ail-atal mewn toddydd modd positif [clorofform/methanol/dŵr (2:7:1) + 5 mM amoniwm asetat] a'i chwistrellu i'r sbectromedr màs. Perfformiwyd monitro aml-adwaith (MRM) ar gyfer adnabod a meintioli moleciwlau sffingolipid. Mae'r sbectromedr màs cwadrupol trydyddol TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) wedi'i gyfarparu â ffynhonnell ïon nano-lif robotig Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ar gyfer dadansoddi lipidau. Mae'r egni gwrthdrawiad wedi'i optimeiddio ar gyfer pob categori ceramid. Cafwyd data MS mewn modd positif. Ar gyfer pob dyblygiad biolegol, y signal lipid yw canolrif tair mesuriad annibynnol.
Fel y disgrifiwyd yn (31), cafodd y celloedd (800 × 107) oedd yn mynegi Gas1-GFP eu rhoi dan imiwno-ddyfodiad naturiol. Gwahanwyd y Gas1-GFP wedi'i buro gan SDS-PAGE a'i drosglwyddo i bilen polyfinyliden fflworid (PVDF). Gwelwyd y protein trwy staenio PVDF ag amid du. Torrwyd y band Gas1-GFP o'r PVDF a'i olchi 5 gwaith â methanol ac unwaith â dŵr gradd cromatograffaeth hylif-MS (LC-MS). Trwy ddeori'r stribed bilen gyda 500μl o 0.3 M NaOAc (pH 4.0), byffer a 500μl o gymysgedd sodiwm nitraid 1 M wedi'i doddi'n ffres ar 37°C am 3 awr, caiff y ffracsiwn lipid ei ryddhau o Gas1-GFP a'i lysio Rhyddhau ceramid ffosffad inosin rhwng glwcosamin ac inositol (51). Ar ôl hynny, golchwyd y stribed bilen bedair gwaith â dŵr gradd LC-MS, ei sychu ar dymheredd ystafell, a'i storio mewn awyrgylch nitrogen ar -80°C tan ei ddadansoddi. Fel rheolydd, defnyddiwyd sampl wag o bilen PVDF ar gyfer pob arbrawf. Yna dadansoddwyd y lipid a echdynnwyd o Gas1-GFP gan ddefnyddio MS fel y disgrifiwyd (50). Yn gryno, ail-ataliwyd stribedi PVDF yn cynnwys GPI-lipid mewn 75μl o doddydd mowld negyddol [clorofform/methanol (1:2) + 5 mM asetat amoniwm] a'u pasio trwy ddadansoddiad ïoneiddio electrochwistrellu (ESI)-MRM/MS o rywogaethau sffingolipid (TSQ Vantage). Yn yr achos hwn, cafwyd data MS mewn modd ïon negyddol.
Fel y soniwyd yn gynharach, gwahanwyd rhan lipid yr angor GPI oddi wrth y GPI-AP wedi'i labelu â [3H]-inositol (16). Gwahanwyd y lipidau trwy gromatograffaeth haen denau gan ddefnyddio system doddydd (55:45:10 clorofform-methanol-0.25% KCl) a'u delweddu gan ddefnyddio FLA-7000 (Fujifilm).
Cafodd y celloedd oedd yn mynegi Gas1-GFP (600×107) eu golchi ddwywaith gyda byffer TNE, a'u torri gyda gleiniau gwydr, ac yna eu hallgyrchu i gael gwared ar falurion celloedd a gleiniau gwydr. Yna cafodd yr uwchnofiant ei allgyrchu ar 17,000 g am 1 awr ar 4°C. Cafodd y belen ei golchi mewn TNE a'i magu gydag 1 U PI-PLC (Invitrogen) mewn TNE yn cynnwys 0.2% saponin digitalis am 1 awr ar 37°C. Ar ôl y driniaeth ensym, tynnwyd y bilen trwy allgyrchu ar 17,000 g ar 4°C am 1 awr. I imiwno-waddodi Gas1-GFP, cafodd yr uwchnofiant ei magu gyda GFP-Trap_A (ChromoTek) ar 4°C dros nos. Cafodd y Gas1-GFP wedi'i buro a wahanwyd gan SDS-PAGE ei staenio â glas llachar Coomassie. Torrwyd y band staenio Gas1-GFP i ffwrdd o'r llwyd o amgylch y draphont, ac yna ar ôl alcyleiddio ag iodoasetamid a lleihau â dithiothreitol, perfformiwyd treuliad yn-gel gyda trypsin. Echdynnwch a sychwch y peptidau tryptig a'r peptidau gyda GPI-glycans. Diddymwyd y peptid sych mewn 20 μl o ddŵr. Chwistrellwch gyfran (8μl) i'r LC. Defnyddiwyd colofn octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diamedr mewnol 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Prefecture Aichi, Japan) i wahanu peptidau o dan amodau graddiant penodol. Y cyfnod symudol yw toddydd A (0.08% asid fformig) a thoddydd B (0.15% asid fformig mewn 80% asetonitril). Defnyddiwyd system Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) i elwtio'r golofn gyda thoddydd A o fewn 55 munud ar gyfradd llif o 50 μl min-1 am 5 munud, ac yna cynyddwyd crynodiad toddydd B i 40%. , Unol Daleithiau America). Cyflwynwyd yr elwad yn barhaus i'r ffynhonnell ïonau ESI, a dadansoddwyd y peptidau tryptig a'r peptidau gyda GPI-glycanau gan LTQ Orbitrap XL (sbectromedr màs trap ïon llinol hybrid-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Yn y gosodiad MS, gosodwyd foltedd y ffynhonnell gapilarïaidd i 4.5 kV, a chadwyd tymheredd y gapilarïaidd trosglwyddo ar 300°C. Gosodwyd foltedd y gapilarïaidd a foltedd lens y tiwb i 15 V a 50 V, yn y drefn honno. Cafwyd data MS yn y modd ïon positif (datrysiad o 60,000; cywirdeb màs o 10 rhan fesul miliwn) mewn ystod màs o gymhareb màs/gwefr 300/m/z (m/z) 3000. Ceir y data MS/MS trwy'r trap ïon yn yr LTQ Orbitrap XL [y 3 digid cyntaf y mae'r data'n dibynnu arnynt, daduniad a achosir gan wrthdrawiad (CID)].
Perfformiwyd efelychiadau MD gan ddefnyddio meddalwedd GROMACS (52) a maes grym MARTINI 2 (53-55). Yna defnyddiwyd Adeiladwr Pilen CHARMM GUI (56, 57) i adeiladu haen ddeuol yn cynnwys dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) a Cer C18 neu DOPC a Cer C26. Mae topoleg a chyfesurynnau Cer C26 yn deillio o DXCE trwy dynnu'r gleiniau ychwanegol o gynffon y sffingosin. Defnyddiwch y broses a ddisgrifir isod i gydbwyso'r haen ddwbl a'i rhedeg, yna defnyddiwch gyfesurynnau olaf y system i adeiladu system sy'n cynnwys Emp24. Adeiladwyd parth trawsbilen burum Emp24 (gweddillion 173 i 193) fel α-helics gan ddefnyddio strwythur moleciwlaidd yr offeryn MD gweledol (VMD) (58). Yna, ar ôl tynnu'r lipidau sy'n gorgyffwrdd, cafodd y protein ei gronynnu'n fras a'i fewnosod i'r haen ddeuol gan ddefnyddio CHARMM GUI. Mae'r system derfynol yn cynnwys 1202 DOPC a 302 Cer C26 neu 1197 DOPC a 295 Cer C18 ac Emp24. Ïoneiddiwch y system i grynodiad o 0.150M. Gwnaed pedwar dyblygiad annibynnol ar gyfer dau gyfansoddiad haen ddeuol.
Mae'r haen ddeulipid yn cael ei chydbwyso gan ddefnyddio'r broses CHARMM GUI, sy'n cynnwys lleihau ac yna cydbwyso 405,000 o gamau, lle mae'r cyfyngiadau safle yn cael eu lleihau a'u dileu'n raddol, a chynyddir y cam amser o 0.005 ps i 0.02 ps. Ar ôl cydbwyso, mae'n cynhyrchu 6 µs gyda cham amser o 0.02 ps. Ar ôl mewnosod Emp24, defnyddiwch yr un broses CHARMM GUI i leihau a chydbwyso'r system, ac yna rhedeg am 8 eiliad mewn cynhyrchiad.
Ar gyfer pob system, yn ystod y broses gydbwyso, rheolir y pwysau gan y barostat Berendsen (59), ac yn ystod y broses gynhyrchu, rheolir y pwysau gan y barostat Parrinello-Rahman (60). Ym mhob achos, y pwysau cyfartalog yw 1 bar a defnyddir cynllun cyplu pwysau lled-isotropig. Yn y broses gydbwyso a chynhyrchu, defnyddir thermostat (61) gydag ail-raddnodi cyflymder i gyplu tymheredd gronynnau protein, lipid a thoddydd yn y drefn honno. Yn ystod y llawdriniaeth gyfan, y tymheredd targed yw 310K. Cyfrifir y rhyngweithio di-fond trwy gynhyrchu rhestr baru gan ddefnyddio'r cynllun Verlet gyda goddefgarwch byffer o 0.005. Cyfrifir y term Coulomb gan ddefnyddio'r maes adwaith a phellter torri o 1.1 nm. Mae term Vander Waals yn defnyddio cynllun torri gyda phellter torri o 1.1 nm, a defnyddir cynllun torri Verlet ar gyfer drifft posibl (62).
Gan ddefnyddio VMD, mae'r donfedd torri rhwng gleiniau ffosffad DOPC neu gleiniau ceramid AM1 a'r protein yn 0.7 nm, a chyfrifir nifer y lipidau sy'n rhyngweithio â'r protein. Yn ôl y fformiwla ganlynol, cyfrifwch y ffactor cyfoethogi-disbyddu (DE) fel yn (63): ffactor DE = (swm y lipidau cyfan yn y protein 0.7) yn y protein 0.7 (swm y Cer mewn lipidau cyfan)
Ceir y gwerth a adroddir fel cyfartaledd, ac mae'r bariau gwall yn bedwar copi annibynnol o SE. Cyfrifir arwyddocâd ystadegol y ffactor DE gan brawf-t [(cyfartaledd-ffactor-DE-1)/SE]. Cyfrifwch y gwerth P o'r dosraniad un-gynffon.
Defnyddiwyd yr offeryn GROMACS i gyfrifo map dwysedd ochrol 2D y system sy'n cynnwys Emp24 o fewn y 250 ns olaf o'r olrhain. Er mwyn cael y map cyfoethogi/disbyddu o seramid, rhennir map dwysedd Cer â swm map Cer a DOPC, ac yna ei rannu â chrynodiad Cer yn y corff. Defnyddir yr un raddfa map lliw.
Am ddeunyddiau atodol ar gyfer yr erthygl hon, gweler http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Mae hon yn erthygl mynediad agored a ddosberthir o dan delerau'r Drwydded Creative Commons Attribution-Non-Commercial, sy'n caniatáu'r defnydd, y dosbarthiad a'r atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng, cyn belled nad yw'r defnydd terfynol at elw masnachol a'r rhagdybiaeth yw bod y gwaith gwreiddiol yn gywir. Cyfeirnod.
Nodyn: Dim ond gofynnwn i chi ddarparu eich cyfeiriad e-bost fel bod y person rydych chi'n ei argymell i'r dudalen yn gwybod eich bod chi eisiau iddyn nhw weld yr e-bost ac nad sbam ydyw. Ni fyddwn yn casglu unrhyw gyfeiriadau e-bost.
Defnyddir y cwestiwn hwn i brofi a ydych chi'n ymwelydd ac atal cyflwyno sbam yn awtomatig.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linezio, Ana Maria Perez -Lipro (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Mae delweddu amser real 3D cydraniad uchel yn datgelu pwysigrwydd hyd cadwyn ceramid ar gyfer didoli protein mewn safleoedd allbwn dethol.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linezio, Ana Maria Perez -Lipro (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Mae delweddu amser real 3D cydraniad uchel yn datgelu pwysigrwydd hyd cadwyn ceramid ar gyfer didoli protein mewn safleoedd allbwn dethol.
©2020 Cymdeithas America er Hyrwyddo Gwyddoniaeth. cedwir pob hawl. Mae AAAS yn bartner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. GwyddoniaethAdvances ISSN 2375-2548.