Fe wnaethom adrodd yn flaenorol fod lefelau serwm y metabolyn tryptoffan sy'n deillio o'r perfedd, asid indole-3-propionig (IPA), yn is mewn cleifion â ffibrosis yr afu. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i'r transcriptome a'r methylome DNA mewn afu gordew mewn perthynas â lefelau IPA serwm, yn ogystal â rôl IPA wrth ysgogi anactifadu ffenoteipig celloedd stellate hepatig (HSCs) in vitro.
Roedd yr astudiaeth yn cynnwys 116 o gleifion gordew heb ddiabetes math 2 (T2DM) (oedran 46.8 ± 9.3 oed; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) a gafodd lawdriniaeth bariatrig yng Nghanolfan Llawfeddygaeth Bariatrig Kuopio (KOBS). Mesurwyd lefelau IPA cylchrediadol trwy gromatograffaeth hylif-sbectrometreg màs (LC-MS), perfformiwyd dadansoddiad trawsgriftom yr afu trwy ddilyniannu RNA cyflawn, a pherfformiwyd dadansoddiad methyliad DNA gan ddefnyddio'r Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Defnyddiwyd celloedd seren hepatig dynol (LX-2) ar gyfer arbrofion in vitro.
Roedd lefelau IPA serwm yn cydberthyn â mynegiant genynnau sy'n ymwneud â llwybrau apoptotig, mitoffagig, a hirhoedledd yn yr afu. Y genyn AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) oedd y genyn rhyngweithiol mwyaf niferus a dominyddol yn nhrawsgrifiad yr afu a phroffiliau methyliad DNA. Achosodd triniaeth IPA apoptosis, gostyngodd resbiradaeth mitocondriaidd, a newidiodd forffoleg celloedd a dynameg mitocondriaidd trwy fodiwleiddio mynegiant genynnau y gwyddys eu bod yn rheoleiddio ffibrosis, apoptosis, a goroesiad celloedd LX-2.
Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn cefnogi bod gan IPA effeithiau therapiwtig posibl a gall ysgogi apoptosis a symud y ffenoteip HSC tuag at gyflwr anactif, a thrwy hynny ehangu'r posibilrwydd o atal ffibrosis yr afu trwy ymyrryd ag actifadu HSC a metaboledd mitocondriaidd.
Mae nifer yr achosion o ordewdra a syndrom metabolig wedi'i gysylltu â chynnydd mewn achosion o glefyd brasterog yr afu sy'n gysylltiedig â metaboledd (MASLD); mae'r clefyd yn effeithio ar 25% i 30% o'r boblogaeth gyffredinol [1]. Prif ganlyniad etioleg MASLD yw ffibrosis yr afu, proses ddeinamig a nodweddir gan groniad parhaus o fatrics allgellog ffibrog (ECM) [2]. Y prif gelloedd sy'n ymwneud â ffibrosis yr afu yw celloedd seren hepatig (HSCs), sy'n arddangos pedwar ffenoteip hysbys: llonydd, wedi'u actifadu, wedi'u hanactifadu, a heneiddio [3, 4]. Gellir actifadu HSCs a thrawswahaniaethu o ffurf llonydd i gelloedd tebyg i ffibroblastau ymledol â gofynion ynni uchel, gyda mwy o fynegiant o α-actin cyhyrau llyfn (α-SMA) a cholagen math I (Col-I) [5, 6]. Yn ystod gwrthdroad ffibrosis yr afu, caiff HSCs wedi'u actifadu eu dileu trwy apoptosis neu anactifadu. Mae'r prosesau hyn yn cynnwys lleihau genynnau ffibrogenig a modiwleiddio genynnau sy'n hybu goroesiad (megis llwybrau signalau NF-κB a PI3K/Akt) [7, 8], yn ogystal â newidiadau mewn dynameg a swyddogaeth mitocondriaidd [9].
Mae lefelau serwm y metabolyn tryptophan asid indole-3-propionig (IPA), a gynhyrchir yn y coluddyn, wedi'u gostwng mewn clefydau metabolaidd dynol gan gynnwys MASLD [10–13]. Mae IPA yn gysylltiedig â chymeriant ffibr dietegol, mae'n adnabyddus am ei effeithiau gwrthocsidiol a gwrthlidiol, ac mae'n gwanhau'r ffenoteip steatohepatitis di-alcohol (NASH) a achosir gan ddeiet in vivo ac in vitro [11–14]. Daw rhywfaint o dystiolaeth o'n hastudiaeth flaenorol, a ddangosodd fod lefelau serwm IPA yn is mewn cleifion â ffibrosis yr afu nag mewn cleifion gordew heb ffibrosis yr afu yn Astudiaeth Llawfeddygaeth Bariatrig Kuopio (KOBS). Ar ben hynny, dangoswyd y gallai triniaeth IPA leihau mynegiant genynnau sy'n farcwyr clasurol o adlyniad celloedd, mudo celloedd ac actifadu celloedd bonyn hematopoietig mewn model celloedd stellate hepatig dynol (LX-2) ac mae'n fetabolyn hepatoprotective posibl [15]. Fodd bynnag, mae'n parhau i fod yn aneglur sut mae IPA yn achosi atchweliad ffibrosis yr afu trwy actifadu apoptosis HSC a bioenergetics mitocondriaidd.
Yma, rydym yn dangos bod IPA serwm yn gysylltiedig â mynegiant genynnau sydd wedi'u cyfoethogi mewn llwybrau apoptosis, mitoffagiaeth, a hirhoedledd yn afu unigolion gordew ond nad ydynt yn ddiabetes math 2 (KOBS). Ar ben hynny, gwelsom y gall IPA ysgogi clirio a diraddio celloedd bonyn hematopoietig wedi'u actifadu (HSCs) trwy'r llwybr anactifadu. Mae'r canlyniadau hyn yn datgelu rôl newydd i IPA, gan ei wneud yn darged therapiwtig posibl i hyrwyddo atchweliad ffibrosis yr afu.
Dangosodd astudiaeth flaenorol yn y garfan KOBS fod gan gleifion â ffibrosis yr afu lefelau IPA cylchrediadol is o'i gymharu â chleifion heb ffibrosis yr afu [15]. Er mwyn eithrio effaith ddryslyd bosibl diabetes math 2, fe wnaethom recriwtio 116 o gleifion gordew heb ddiabetes math 2 (oedran cymedrig ± SD: 46.8 ± 9.3 oed; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabl 1) o'r astudiaeth KOBS barhaus fel y boblogaeth astudio [16]. Rhoddodd yr holl gyfranogwyr ganiatâd gwybodus ysgrifenedig a chymeradwywyd protocol yr astudiaeth gan Bwyllgor Moeseg Ysbyty Sir Gogledd Savo yn unol â Datganiad Helsinki (54/2005, 104/2008 a 27/2010).
Cafwyd sbesimenau biopsi afu yn ystod llawdriniaeth bariatrig a'u hasesu'n histolegol gan batholegwyr profiadol yn unol â'r meini prawf a ddisgrifiwyd yn flaenorol [17, 18]. Crynhoir y meini prawf asesu yn Nhabl Atodol S1 ac maent wedi'u disgrifio'n flaenorol [19].
Dadansoddwyd samplau serwm ymprydio gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif heb ei thargedu-sbectrometreg màs (LC-MS) ar gyfer dadansoddiad metabolomeg (n = 116). Dadansoddwyd samplau gan ddefnyddio system UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, yr Almaen) fel y disgrifiwyd yn flaenorol19. Roedd adnabod alcohol isopropyl (IPA) yn seiliedig ar amser cadw a chymhariaeth o'r sbectrwm MS/MS â safonau pur. Ystyriwyd dwyster signal IPA (arwynebedd brig) ym mhob dadansoddiad pellach [20].
Perfformiwyd dilyniannu RNA yr afu cyfan gan ddefnyddio Illumina HiSeq 2500 a phroseswyd y data ymlaen llaw fel y disgrifiwyd yn flaenorol [19, 21, 22]. Gwnaethom ddadansoddiad mynegiant gwahaniaethol wedi'i dargedu o drawsgrifiadau sy'n effeithio ar swyddogaeth/biogenesis mitocondriaidd gan ddefnyddio 1957 o enynnau a ddewiswyd o gronfa ddata MitoMiner 4.0 [23]. Perfformiwyd dadansoddiad methyliad DNA'r afu gan ddefnyddio'r Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, UDA) gan ddefnyddio'r un fethodoleg ag a ddisgrifiwyd yn flaenorol [24, 25].
Darparwyd celloedd seren hepatig dynol (LX-2) yn garedig gan yr Athro Stefano Romeo a chawsant eu meithrin a'u cynnal mewn cyfrwng DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). I ddewis y dos gweithio o IPA, cafodd celloedd LX-2 eu trin â gwahanol grynodiadau o IPA (10 μM, 100 μM ac 1 mM; Sigma, 220027) mewn cyfrwng DMEM/F12 am 24 awr. Ar ben hynny, i ymchwilio i allu IPA i ddadactifadu celloedd seren hepatig dynol, cafodd celloedd LX-2 eu trin ar y cyd â 5 ng/ml TGF-β1 (systemau Ymchwil a Datblygu, 240-B-002/CF) ac 1 mM IPA mewn cyfrwng di-serwm am 24 awr. Ar gyfer y rheolyddion cerbydau cyfatebol, defnyddiwyd 4 nM HCL yn cynnwys 0.1% BSA ar gyfer triniaeth TGF-β1 a defnyddiwyd 0.05% DMSO ar gyfer triniaeth IPA, a defnyddiwyd y ddau gyda'i gilydd ar gyfer y driniaeth gyfunol.
Aseswyd apoptosis gan ddefnyddio'r Pecyn Canfod Apoptosis FITC Annexin V gyda 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, UDA, Cat# 640922) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, cafodd LX-2 (1 × 105 cell/ffynnon) eu meithrin dros nos mewn platiau 12-ffynnon ac yna eu trin â dosau lluosog o IPA neu IPA a TGF-β1. Y diwrnod canlynol, casglwyd celloedd arnofiol a chelloedd glynu, eu trypsineiddio, eu golchi â PBS, eu hail-atal mewn byffer rhwymo Annexin V, a'u magu gyda FITC-Annexin V a 7-AAD am 15 munud.
Cafodd mitochondria mewn celloedd byw eu lliwio am weithgaredd ocsideiddiol gan ddefnyddio Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Ar gyfer asesiadau MTR, cafodd celloedd LX-2 eu magu ar ddwyseddau cyfartal ag IPA a TGF-β1. Ar ôl 24 awr, cafodd celloedd byw eu trypsineiddio, eu golchi â PBS, ac yna eu magu â 100 μM MTR mewn cyfrwng di-serwm ar 37 °C am 20 munud fel y disgrifiwyd yn flaenorol [26]. Ar gyfer dadansoddi morffoleg celloedd byw, dadansoddwyd maint celloedd a chymhlethdod cytoplasmig gan ddefnyddio paramedrau gwasgariad ymlaen (FSC) a gwasgariad ochr (SSC), yn y drefn honno.
Cafwyd yr holl ddata (30,000 o ddigwyddiadau) gan ddefnyddio NovoCyte Quanteon (Agilent) a'i ddadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd NovoExpress® 1.4.1 neu FlowJo V.10.
Mesurwyd cyfradd defnydd ocsigen (OCR) a chyfradd asideiddio allgellog (ECAR) mewn amser real gan ddefnyddio Dadansoddwr Fflwcs Allgellog Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) wedi'i gyfarparu â Straen Mito Cell Seahorse XF yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, hauwyd 2 × 104 celloedd LX-2/ffynnon ar blatiau diwylliant celloedd XF96. Ar ôl magu dros nos, triniwyd celloedd ag isopropanol (IPA) a TGF-β1 (Dulliau Atodol 1). Perfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio meddalwedd Seahorse XF Wave, sy'n cynnwys Cynhyrchydd Adroddiad Prawf Ffenoteip Ynni Celloedd Seahorse XF. O hyn, cyfrifwyd Mynegai Iechyd Bioegnïol (BHI) [27].
Trawsgrifiwyd cyfanswm yr RNA i cDNA. Am ddulliau penodol, gweler cyfeirnod [15]. Defnyddiwyd lefelau mRNA protein asidig ribosomal 60S dynol P0 (RPLP0) a cyclophilin A1 (PPIA) fel rheolyddion genynnau cyfansoddol. Defnyddiwyd System PCR Amser Real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Yr Iseldiroedd) gyda'r Pecyn Cymysgedd Meistr Uwch Cyflym TaqMan™ (Applied Biosystems) neu'r Pecyn Lo-ROX Sensifast SYBR (Bioline, BIO 94050), a chyfrifwyd plyg mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio paramedrau beicio gwerth Ct cymharol (ΔΔCt) a'r dull ∆∆Ct. Darperir manylion y primerau yn Nhablau Atodol S2 ac S3.
Cafodd DNA niwclear (ncDNA) a DNA mitocondriaidd (mtDNA) eu tynnu gan ddefnyddio'r pecyn gwaed a meinwe DNeasy (Qiagen) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [28]. Cyfrifwyd y swm cymharol o mtDNA trwy gyfrifo cymhareb pob rhanbarth mtDNA targed i gymedr geometrig y tri rhanbarth DNA niwclear (mtDNA/ncDNA), fel y manylir yn Nulliau Atodol 2. Darperir manylion y primerau ar gyfer mtDNA ac ncDNA yn Nhabl Atodol S4.
Cafodd celloedd byw eu lliwio â Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) i ddelweddu rhwydweithiau mitocondriaidd rhynggellog ac mewngellol. Cafodd celloedd LX-2 (1 × 104 cell/ffynnon) eu meithrin ar sleidiau gwydr mewn platiau diwylliant gwaelod gwydr cyfatebol (Ibidi GmbH, Martinsried, yr Almaen). Ar ôl 24 awr, cafodd celloedd LX-2 byw eu meithrin â 100 μM MTR am 20 munud ar 37 °C a chafodd niwclysau celloedd eu lliwio â DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [29]. Cafodd rhwydweithiau mitocondriaidd eu lliwio gan ddefnyddio microsgop gwrthdro Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, yr Almaen) a oedd â modiwl confocal Zeiss LSM 800 ar 37 °C mewn awyrgylch llaith gyda 5% CO2 gan ddefnyddio amcan 63 × NA 1.3. Fe wnaethon ni gael deg delwedd cyfres-Z ar gyfer pob math o sampl. Mae pob cyfres Z yn cynnwys 30 adran, pob un â thrwch o 9.86 μm. Ar gyfer pob sampl, caffaelwyd delweddau o ddeg maes golygfa gwahanol gan ddefnyddio meddalwedd ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, yr Almaen), a pherfformiwyd dadansoddiad morffoleg mitocondriaidd gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ (v1.54d) [30, 31] yn ôl y paramedrau a nodir yn Nulliau Atodol 3.
Cafodd y celloedd eu trwsio gyda 2% glutaraldehyd mewn byffer ffosffad 0.1 M, ac yna eu trwsio gyda hydoddiant osmiwm tetrocsid 1% (Sigma Aldrich, MO, UDA), eu dadhydradu'n raddol gydag aseton (Merck, Darmstadt, yr Almaen), ac yn olaf eu mewnosod mewn resin epocsi. Paratowyd adrannau ultradenau a'u staenio gydag 1% asetad wranyl (Merck, Darmstadt, yr Almaen) ac 1% sitrad plwm (Merck, Darmstadt, yr Almaen). Cafwyd delweddau uwchstrwythurol gan ddefnyddio microsgop electron trosglwyddo JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ar foltedd cyflymu o 80 kV.
Dadansoddwyd morffoleg celloedd LX-2 a gafodd eu trin ag IPA am 24 awr trwy ficrosgopeg cyferbyniad-cyfnod ar chwyddiad o 50x gan ddefnyddio microsgop golau gwrthdro Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 ac AxioCam MRm, Jena, yr Almaen).
Mynegwyd data clinigol fel cymedr ± gwyriad safonol neu ganolrif (amrediad rhyngchwartel: IQR). Defnyddiwyd dadansoddiad amrywiant unffordd (newidynnau parhaus) neu brawf χ² (newidynnau categorïaidd) i gymharu gwahaniaethau rhwng y tri grŵp astudio. Defnyddiwyd y gyfradd positif ffug (FDR) i gywiro ar gyfer profion lluosog, ac ystyriwyd bod genynnau ag FDR < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Defnyddiwyd dadansoddiad cydberthynas Spearman i gydberthyn methyliad DNA CpG â dwyster signal IPA, gyda gwerthoedd p enwol (p < 0.05) yn cael eu hadrodd.
Perfformiwyd dadansoddiad llwybr gan ddefnyddio offeryn dadansoddi setiau genynnau ar y we (WebGestalt) ar gyfer 268 o drawsgrifiadau (p enwol < 0.01), 119 o drawsgrifiadau sy'n gysylltiedig â mitochondria (p enwol < 0.05), a 4350 o CpGs allan o 3093 o drawsgrifiadau afu a oedd yn gysylltiedig â lefelau IPA serwm cylchredol. Defnyddiwyd yr offeryn Venny DB (fersiwn 2.1.0) sydd ar gael am ddim i ddod o hyd i enynnau sy'n gorgyffwrdd, a defnyddiwyd StringDB (fersiwn 11.5) i ddelweddu rhyngweithiadau protein-protein.
Ar gyfer yr arbrawf LX-2, profwyd samplau am normalrwydd gan ddefnyddio prawf D'Agostino-Pearson. Cafwyd data o o leiaf dri dyblygiad biolegol a chawsant ANOVA unffordd gyda phrawf ôl-hoc Bonferroni. Ystyriwyd bod gwerth-p o lai na 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Cyflwynir data fel cymedr ± SD, a nodir nifer yr arbrofion ym mhob ffigur. Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau a graffiau gan ddefnyddio meddalwedd ystadegol GraphPad Prism 8 ar gyfer Windows (GraphPad Software Inc., fersiwn 8.4.3, San Diego, UDA).
Yn gyntaf, fe wnaethom ymchwilio i'r cysylltiad rhwng lefelau IPA serwm a thrawsgrifiadau'r afu, y corff cyfan, a mitocondriaidd. Yn y proffil trawsgrifiad cyfan, y genyn cryfaf sy'n gysylltiedig â lefelau IPA serwm oedd MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; protein kinase wedi'i actifadu gan mitogen-activated protein kinase 3); yn y proffil trawsgrifiad sy'n gysylltiedig â mitocondria, y genyn cysylltiedig cryfaf oedd AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Ffeil Ychwanegol 1 a Ffeil Ychwanegol 2).
Yna, dadansoddwyd trawsgrifiadau byd-eang (n = 268; p < 0.01) a thrawsgrifiadau sy'n gysylltiedig â mitochondria (n = 119; p < 0.05), gan nodi yn y pen draw mai apoptosis oedd y llwybr canonaidd mwyaf arwyddocaol (p = 0.0089). Ar gyfer trawsgrifiadau mitocondriaidd sy'n gysylltiedig â lefelau IPA serwm, canolbwyntiwyd ar apoptosis (FDR = 0.00001), mitoffagiaeth (FDR = 0.00029), a llwybrau signalau TNF (FDR = 0.000006) (Ffigur 1A, Tabl 2, a Ffigurau Atodol 1A-B).
Dadansoddiad gorgyffwrdd o drawsgrifiadau byd-eang, sy'n gysylltiedig â mitochondria, a methyliad DNA yn afu dynol mewn cysylltiad â lefelau IPA serwm. Mae A yn cynrychioli 268 o drawsgrifiadau byd-eang, 119 o drawsgrifiadau sy'n gysylltiedig â mitochondria, a thrawsgrifiadau methyledig DNA sydd wedi'u mapio i 3092 o safleoedd CpG sy'n gysylltiedig â lefelau IPA serwm (gwerthoedd p < 0.01 ar gyfer trawsgrifiadau byd-eang a DNA methyledig, a gwerthoedd p < 0.05 ar gyfer trawsgrifiadau mitochondria). Dangosir y prif drawsgrifiadau sy'n gorgyffwrdd yn y canol (AKT1 ac YKT6). B Adeiladwyd map rhyngweithio'r 13 genyn gyda'r sgôr rhyngweithio uchaf (0.900) â genynnau eraill o'r 56 genyn sy'n gorgyffwrdd (rhanbarth llinell ddu) a oedd yn gysylltiedig yn sylweddol â lefelau IPA serwm gan ddefnyddio'r offeryn ar-lein StringDB. Gwyrdd: Genynnau wedi'u mapio i'r gydran gellog Ontoleg Genynnau (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 yw'r protein gyda'r sgôr uchaf (0.900) ar gyfer rhyngweithiadau â phroteinau eraill yn seiliedig ar y data (yn seiliedig ar gloddio testun, arbrofion, cronfeydd data, a chyd-fynegiant). Mae nodau rhwydwaith yn cynrychioli proteinau, ac mae ymylon yn cynrychioli cysylltiadau rhwng proteinau.
Gan y gall metabolion microbiota'r perfedd reoleiddio cyfansoddiad epigenetig trwy fethyleiddio DNA [32], fe wnaethom ymchwilio i weld a oedd lefelau IPA serwm yn gysylltiedig â methyleiddio DNA'r afu. Fe wnaethom ganfod bod y ddau brif safle methyleiddio sy'n gysylltiedig â lefelau IPA serwm yn agos at ranbarth 3 sy'n gyfoethog mewn prolin-serin (C19orf55) ac aelod 6 o deulu protein sioc gwres B (bach) (HSPB6) (Ffeil ychwanegol 3). Roedd methyleiddio DNA 4350 CpG (p < 0.01) yn gysylltiedig â lefelau IPA serwm ac roedd wedi'i gyfoethogi mewn llwybrau rheoleiddio hirhoedledd (p = 0.006) (Ffigur 1A, Tabl 2, a Ffigur Atodol 1C).
Er mwyn deall y mecanweithiau biolegol sy'n sail i'r cysylltiadau rhwng lefelau IPA serwm, trawsgrifiadau byd-eang, trawsgrifiadau sy'n gysylltiedig â mitochondria, a methyliad DNA yn afu dynol, fe wnaethom gynnal dadansoddiad gorgyffwrdd o'r genynnau a nodwyd yn y dadansoddiad llwybr blaenorol (Ffigur 1A). Dangosodd canlyniadau dadansoddiad cyfoethogi llwybr y 56 genyn sy'n gorgyffwrdd (y tu mewn i'r llinell ddu yn Ffigur 1A) fod y llwybr apoptosis (p = 0.00029) yn tynnu sylw at ddau enyn sy'n gyffredin i'r tri dadansoddiad: AKT1 ac YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), fel y dangosir yn y diagram Venn (Ffigur Atodol 2 a Ffigur 1A). Yn ddiddorol, gwelsom fod AKT1 (cg19831386) ac YKT6 (cg24161647) wedi'u cydberthyn yn gadarnhaol â lefelau IPA serwm (Ffeil Ychwanegol 3). Er mwyn nodi rhyngweithiadau protein posibl rhwng cynhyrchion genynnau, fe wnaethom ddewis 13 genyn gyda'r sgôr rhanbarth cyffredin uchaf (0.900) ymhlith 56 genyn sy'n gorgyffwrdd fel mewnbwn ac adeiladu map rhyngweithio. Yn ôl y lefel hyder (hyder ymylol), roedd y genyn AKT1 gyda'r sgôr uchaf (0.900) ar y brig (Ffigur 1B).
Yn seiliedig ar y dadansoddiad llwybr, gwelsom mai apoptosis oedd y prif lwybr, felly fe wnaethom ymchwilio i weld a fyddai triniaeth IPA yn effeithio ar apoptosis celloedd HSC in vitro. Dangosom yn flaenorol nad oedd gwahanol ddosau o IPA (10 μM, 100 μM, ac 1 mM) yn wenwynig i gelloedd LX-2 [15]. Dangosodd yr astudiaeth hon fod triniaeth IPA ar 10 μM a 100 μM wedi cynyddu nifer y celloedd hyfyw a necrotig. Fodd bynnag, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, gostyngodd hyfywedd celloedd ar grynodiad IPA o 1 mM, tra arhosodd cyfradd necrosis celloedd yr un fath (Ffigur 2A, B). Nesaf, i ddod o hyd i'r crynodiad gorau posibl i ysgogi apoptosis mewn celloedd LX-2, fe wnaethom brofi 10 μM, 100 μM, ac 1 mM IPA am 24 awr (Ffigur 2A-E a Ffigur Atodol 3A-B). Yn ddiddorol, gostyngodd IPA 10 μM a 100 μM y gyfradd apoptosis (%), fodd bynnag, cynyddodd IPA 1 mM apoptosis hwyr a chyfradd apoptosis (%) o'i gymharu â'r rheolydd ac felly fe'i dewiswyd ar gyfer arbrofion pellach (Ffigurau 2A–D).
Mae IPA yn achosi apoptosis celloedd LX-2. Defnyddiwyd dull staenio dwbl Annexin V a 7-AAD i fesur y gyfradd apoptotig a morffoleg celloedd trwy cytometry llif. Cafodd celloedd BA eu magu gyda 10 μM, 100 μM ac 1 mM IPA am 24 awr neu gyda F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ac 1 mM IPA mewn cyfrwng di-serwm am 24 awr. A: celloedd byw (Annexin V -/ 7AAD-); B: celloedd necrotig (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: cynnar (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: hwyr (Annexin V+/7AAD.+); E, H: canran cyfanswm y celloedd apoptotig cynnar a hwyr mewn cyfradd apoptotig (%). Mynegir data fel cymedr ± SD, n = 3 arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymhariaethau ystadegol gan ddefnyddio ANOVA unffordd gyda phrawf post hoc Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Fel yr ydym wedi dangos yn flaenorol, gall 5 ng/ml o TGF-β1 ysgogi actifadu HSC trwy gynyddu mynegiant genynnau marciwr clasurol [15]. Cafodd celloedd LX-2 eu trin â 5 ng/ml o TGF-β1 ac 1 mM IPA mewn cyfuniad (Ffig. 2E–H). Ni newidiodd triniaeth TGF-β1 y gyfradd apoptosis, fodd bynnag, cynyddodd cyd-driniaeth IPA apoptosis hwyr a chyfradd apoptosis (%) o'i gymharu â thriniaeth TGF-β1 (Ffig. 2E–H). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall 1 mM IPA hyrwyddo apoptosis mewn celloedd LX-2 yn annibynnol ar ysgogiad TGF-β1.
Fe wnaethon ni ymchwilio ymhellach i effaith IPA ar resbiradaeth mitocondriaidd mewn celloedd LX-2. Dangosodd y canlyniadau fod 1 mM IPA wedi lleihau'r paramedrau cyfradd defnydd ocsigen (OCR): resbiradaeth nad yw'n fitocondriaidd, resbiradaeth sylfaenol ac uchaf, gollyngiad proton a chynhyrchu ATP o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 3A, B), tra na newidiodd y mynegai iechyd bio-egnïol (BHI).
Mae IPA yn lleihau resbiradaeth mitocondriaidd mewn celloedd LX-2. Cyflwynir y gromlin resbiradaeth mitocondriaidd (OCR) fel paramedrau resbiradaeth mitocondriaidd (resbiradaeth nad yw'n fitocondriaidd, resbiradaeth sylfaenol, resbiradaeth uchaf, gollyngiad proton, cynhyrchu ATP, SRC a BHI). Cafodd celloedd A a B eu magu gyda 10 μM, 100 μM ac 1 mM IPA am 24 awr, yn y drefn honno. Cafodd celloedd C a D eu magu gyda TGF-β1 (5 ng/ml) ac 1 mM IPA mewn cyfrwng di-serwm am 24 awr, yn y drefn honno. Cafodd yr holl fesuriadau eu normaleiddio i gynnwys DNA gan ddefnyddio'r pecyn CyQuant. BHI: mynegai iechyd bio-egnïol; SRC: capasiti wrth gefn resbiradol; OCR: cyfradd defnydd ocsigen. Cyflwynir data fel cymedr ± gwyriad safonol (SD), n = 5 arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymhariaethau ystadegol gan ddefnyddio ANOVA unffordd a phrawf ôl-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; a ***p < 0.001
Er mwyn cael dealltwriaeth fwy cynhwysfawr o effaith IPA ar broffil bio-egnïol celloedd LX-2 wedi'u actifadu gan TGF-β1, dadansoddom ffosfforyleiddiad ocsideiddiol mitocondriaidd gan OCR (Ffig. 3C,D). Dangosodd y canlyniadau y gallai triniaeth TGF-β1 leihau'r anadlu mwyaf, y capasiti wrth gefn anadlol (SRC) a'r BHI o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. 3C,D). Yn ogystal, gostyngodd y driniaeth gyfunol anadlu sylfaenol, gollyngiad proton a chynhyrchiad ATP, ond roedd SRC a BHI yn sylweddol uwch na'r rhai a gafodd driniaeth â TGF-β1 (Ffig. 3C,D).
Fe wnaethon ni hefyd gynnal y "Prawf Ffenoteip Ynni Cellog" a ddarparwyd gan feddalwedd Seahorse (Ffig. Atodol 4A–D). Fel y dangosir yn Ffig. Atodol 3B, gostyngwyd potensialau metabolaidd OCR ac ECAR ar ôl triniaeth TGF-β1, fodd bynnag, ni welwyd unrhyw wahaniaeth yn y grwpiau triniaeth cyfuniad ac IPA o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Ar ben hynny, gostyngwyd lefelau sylfaenol a straen OCR ar ôl triniaeth gyfuniad ac IPA o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. Atodol 4C). Yn ddiddorol, gwelwyd patrwm tebyg gyda therapi cyfuniad, lle na welwyd unrhyw newid yn lefelau sylfaenol a straen ECAR o'i gymharu â thriniaeth TGF-β1 (Ffig. Atodol 4C). Mewn celloedd gwaed uchel (HSCs), ni newidiodd y gostyngiad mewn ffosfforyleiddiad ocsideiddiol mitocondriaidd a gallu triniaeth gyfuniad i adfer SCR a BHI ar ôl dod i gysylltiad â thriniaeth TGF-β1 y potensial metabolaidd (OCR ac ECAR). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall IPA leihau bio-egnïaeth mewn celloedd gwaed uchel, gan awgrymu y gall IPA ysgogi proffil egnïol is sy'n symud y ffenoteip HSC tuag at anactifadu (Ffig. Atodol 4D).
Ymchwiliwyd i effaith IPA ar ddeinameg mitocondriaidd gan ddefnyddio meintioli tri dimensiwn morffoleg mitocondriaidd a chysylltiadau rhwydwaith yn ogystal â staenio MTR (Ffigur 4 a Ffigur Atodol 5). Mae Ffigur 4 yn dangos, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, fod triniaeth TGF-β1 wedi lleihau'r arwynebedd cymedrig, nifer y canghennau, cyfanswm hyd y canghennau, a nifer y gyffordd canghennau (Ffigur 4A a B) a newid cyfran y mitochondria o forffoleg sfferig i forffoleg ganolradd (Ffigur 4C). Dim ond triniaeth IPA a leihaodd y gyfaint mitocondriaidd cymedrig a newid cyfran y mitochondria o forffoleg sfferig i ganolradd o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 4A). Mewn cyferbyniad, arhosodd sfferigrwydd, hyd cangen cymedrig, a gweithgaredd mitocondriaidd a aseswyd gan MTR sy'n ddibynnol ar botensial pilen mitocondriaidd (Ffigur 4A ac E) heb eu newid ac nid oedd y paramedrau hyn yn wahanol rhwng grwpiau. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod triniaeth TGF-β1 ac IPA yn ymddangos i fodiwleiddio siâp a maint mitocondriaidd yn ogystal â chymhlethdod rhwydwaith mewn celloedd LX-2 byw.
Mae IPA yn newid dynameg mitocondriaidd a helaethrwydd DNA mitocondriaidd mewn celloedd LX-2. A. Delweddau confocal cynrychioliadol o gelloedd LX-2 byw wedi'u deori gyda TGF-β1 (5 ng/ml) ac 1 mM IPA am 24 awr mewn cyfrwng di-serwm yn dangos rhwydweithiau mitocondriaidd wedi'u staenio â Mitotracker™ Red CMXRos a niwclysau wedi'u staenio'n las gyda DAPI. Roedd yr holl ddata yn cynnwys o leiaf 15 delwedd fesul grŵp. Fe wnaethom gaffael 10 delwedd Z-stack ar gyfer pob math o sampl. Roedd pob dilyniant echelin-Z yn cynnwys 30 sleisen, pob un â thrwch o 9.86 μm. Bar graddfa: 10 μm. B. Gwrthrychau cynrychioliadol (mitochondria yn unig) a nodwyd trwy gymhwyso trothwy addasol i'r ddelwedd. Perfformiwyd dadansoddiad meintiol a chymhariaeth o gysylltiadau rhwydwaith morffolegol mitocondriaidd ar gyfer pob cell ym mhob grŵp. C. Amlder cymhareb siâp mitocondriaidd. Mae gwerthoedd yn agos at 0 yn dynodi siapiau sfferig, ac mae gwerthoedd yn agos at 1 yn dynodi siapiau ffilamentog. D Penderfynwyd cynnwys DNA mitocondriaidd (mtDNA) fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau. Perfformiwyd dadansoddiad E Mitotracker™ Red CMXRos gan ddefnyddio cytometry llif (30,000 o ddigwyddiadau) fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau. Cyflwynir data fel cymedr ± SD, n = 3 arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymariaethau ystadegol gan ddefnyddio ANOVA unffordd a phrawf ôl-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Yna, dadansoddwyd cynnwys mtDNA celloedd LX-2 fel dangosydd o nifer mitocondriaidd. O'i gymharu â'r grŵp rheoli, cynyddodd cynnwys mtDNA yn y grŵp a gafodd driniaeth TGF-β1 (Ffigur 4D). O'i gymharu â'r grŵp a gafodd driniaeth TGF-β1, gostyngodd cynnwys mtDNA yn y grŵp triniaeth gyfunol (Ffigur 4D), gan awgrymu y gallai IPA leihau cynnwys mtDNA ac o bosibl nifer mitocondriaidd yn ogystal ag anadlu mitocondriaidd (Ffigur 3C). Ar ben hynny, roedd yn ymddangos bod IPA yn lleihau cynnwys mtDNA yn y driniaeth gyfunol ond ni effeithiodd ar weithgaredd mitocondriaidd a gyfryngwyd gan MTR (Ffigurau 4A–C).
Fe wnaethon ni ymchwilio i'r cysylltiad rhwng IPA a lefelau mRNA genynnau sy'n gysylltiedig â ffibrosis, apoptosis, goroesiad, a dynameg mitocondriaidd mewn celloedd LX-2 (Ffigur 5A–D). O'i gymharu â'r grŵp rheoli, dangosodd y grŵp a gafodd driniaeth TGF-β1 fynegiant cynyddol o enynnau fel cadwyn α2 math I colagen (COL1A2), actin cyhyrau llyfn α-α (αSMA), metalloproteinase matrics 2 (MMP2), atalydd meinwe metalloproteinase 1 (TIMP1), a genyn tebyg i dynamin 1 (DRP1), sy'n dynodi cynnydd mewn ffibrosis ac actifadu. Ar ben hynny, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, gostyngodd triniaeth TGF-β1 lefelau mRNA derbynnydd pregnane X niwclear (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, atalydd celloedd-B α, gwellaydd peptid golau genyn ffactor niwclear κ (NFκB1A), ac atalydd is-uned kinase ffactor niwclear κB β (IKBKB) (Ffigur 5A–D). O'i gymharu â thriniaeth TGF-β1, gostyngodd triniaeth gyfunol gyda TGF-β1 ac IPA fynegiant COL1A2 a MMP2, ond cynyddodd lefelau mRNA PXR, TIMP1, lymffoma celloedd-B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, ac IKBKB. Gostyngodd triniaeth IPA fynegiant MMP2, protein X sy'n gysylltiedig â Bcl-2 (BAX), AKT1, protein atroffi optig 1 (OPA1), a phrotein ymasiad mitocondriaidd 2 (MFN2) yn sylweddol, tra bod mynegiant CASP8, NFκB1A, NFκB1B, ac IKBKB wedi cynyddu o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaeth yn mynegiant caspase-3 (CASP3), ffactor actifadu peptidase apoptotig 1 (APAF1), protein ymasiad mitocondriaidd 1 (MFN1), a phrotein ymholltiad 1 (FIS1). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod triniaeth IPA yn modiwleiddio mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â ffibrosis, apoptosis, goroesiad, a dynameg mitocondriaidd. Mae ein data yn awgrymu bod triniaeth IPA yn lleihau ffibrosis mewn celloedd LX-2; ar yr un pryd, mae'n ysgogi goroesiad trwy symud y ffenoteip tuag at anactifadu.
Mae IPA yn modiwleiddio mynegiant genynnau ffibroblast, apoptotig, hyfywedd, a deinameg mitocondriaidd mewn celloedd LX-2. Mae histogramau yn dangos mynegiant mRNA o'i gymharu â rheolaeth endogenaidd (RPLP0 neu PPIA) ar ôl i gelloedd LX-2 gael eu hysgogi â TGF-β1 ac IPA mewn cyfrwng di-serwm am 24 awr. Mae A yn dynodi ffibroblastau, mae B yn dynodi celloedd apoptotig, mae C yn dynodi celloedd sy'n goroesi, ac mae D yn dynodi mynegiant genynnau deinameg mitocondriaidd. Cyflwynir data fel cymedr ± gwyriad safonol (SD), n = 3 arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymariaethau ystadegol gan ddefnyddio ANOVA unffordd a phrawf ôl-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Yna, aseswyd newidiadau ym maint y gell (FSC-H) a chymhlethdod y cytoplasm (SSC-H) gan ddefnyddio cytometry llif (Ffigur 6A,B), ac aseswyd newidiadau ym morffoleg y gell ar ôl triniaeth IPA gan ddefnyddio microsgopeg electron trosglwyddo (TEM) a microsgopeg cyferbyniad cyfnod (Ffigur Atodol 6A-B). Fel y disgwyliwyd, cynyddodd maint y celloedd yn y grŵp a gafodd driniaeth TGF-β1 o ran maint o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 6A,B), gan ddangos ehangu clasurol y reticwlwm endoplasmig garw (ER*) a'r ffagolysosomau (P), gan ddangos actifadu celloedd bonyn hematopoietig (HSC) (Ffigur Atodol 6A). Fodd bynnag, o'i gymharu â'r grŵp a gafodd driniaeth TGF-β1, gostyngwyd maint y gell, cymhlethdod y cytoplasm (Ffig. 6A,B), a chynnwys ER* yn y grŵp triniaeth cyfuniad TGF-β1 ac IPA (Ffig. Atodol 6A). Ar ben hynny, gostyngodd triniaeth IPA faint y gell, cymhlethdod y cytoplasm (Ffig. 6A,B), cynnwys P ac ER* (Ffig. Atodol 6A) o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Yn ogystal, cynyddodd cynnwys celloedd apoptotig ar ôl 24 awr o driniaeth IPA o'i gymharu â'r grŵp rheoli (saethau gwyn, Ffig. Atodol 6B). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall 1 mM IPA ysgogi apoptosis HSC a gwrthdroi'r newidiadau mewn paramedrau morffolegol celloedd a achosir gan TGF-β1, a thrwy hynny reoleiddio maint a chymhlethdod y gell, a all fod yn gysylltiedig ag anactifadu HSC.
Mae IPA yn newid maint celloedd a chymhlethdod cytoplasmig mewn celloedd LX-2. Delweddau cynrychioliadol o ddadansoddiad cytometry llif. Defnyddiodd y dadansoddiad strategaeth gatio benodol ar gyfer celloedd LX-2: SSC-A/FSC-A i ddiffinio poblogaeth y celloedd, FSC-H/FSC-A i nodi dwbledi, a SSC-H/FSC-H ar gyfer dadansoddiad maint a chymhlethdod celloedd. Cafodd celloedd eu magu gyda TGF-β1 (5 ng/ml) ac 1 mM IPA mewn cyfrwng di-serwm am 24 awr. Dosbarthwyd celloedd LX-2 i'r cwadrant chwith isaf (SSC-H-/FSC-H-), y cwadrant chwith uchaf (SSC-H+/FSC-H-), y cwadrant dde isaf (SSC-H-/FSC-H+), a'r cwadrant dde uchaf (SSC-H+/FSC-H+) ar gyfer dadansoddiad maint celloedd a chymhlethdod cytoplasmig. B. Dadansoddwyd morffoleg celloedd gan ddefnyddio cytometry llif gan ddefnyddio FSC-H (gwasgariad ymlaen, maint celloedd) a SSC-H (gwasgariad ochr, cymhlethdod cytoplasmig) (30,000 o ddigwyddiadau). Cyflwynir data fel cymedr ± SD, n = 3 arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymariaethau ystadegol gan ddefnyddio ANOVA unffordd a phrawf ôl-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 a ****p < 0.0001
Mae metabolion y coluddyn fel IPA wedi dod yn bwnc ymchwil poblogaidd, gan awgrymu y gellir darganfod targedau newydd ym microbiota'r coluddyn. Felly mae'n ddiddorol bod IPA, metabolyn yr ydym wedi'i gysylltu â ffibrosis yr afu mewn bodau dynol [15], wedi'i ddangos i fod yn gyfansoddyn gwrth-ffibrotig posibl mewn modelau anifeiliaid [13, 14]. Yma, rydym yn dangos am y tro cyntaf gysylltiad rhwng IPA serwm a thranscriptomics yr afu byd-eang a methyliad DNA mewn unigolion gordew heb ddiabetes math 2 (T2D), gan amlygu apoptosis, mitoffagiaeth a hirhoedledd, yn ogystal â genyn ymgeisydd posibl AKT1 sy'n rheoleiddio homeostasis yr afu. Newydd-deb arall yn ein hastudiaeth yw ein bod wedi dangos rhyngweithio triniaeth IPA ag apoptosis, morffoleg celloedd, bioenergeteg mitocondriaidd a deinameg mewn celloedd LX-2, gan nodi sbectrwm ynni is sy'n symud y ffenoteip HSC tuag at anactifadu, gan wneud IPA yn ymgeisydd posibl ar gyfer gwella ffibrosis yr afu.
Fe wnaethon ni ganfod mai apoptosis, mitoffagiaeth a hirhoedledd oedd y llwybrau canonaidd pwysicaf a oedd wedi'u cyfoethogi mewn genynnau afu sy'n gysylltiedig ag IPA serwm sy'n cylchredeg. Gall amharu ar y system rheoli ansawdd mitocondriaidd (MQC) arwain at gamweithrediad mitocondriaidd, mitoffagiaeth ac apoptosis, a thrwy hynny hyrwyddo digwyddiad MASLD[33, 34]. Felly, gallwn ddyfalu y gallai IPA fod yn rhan o gynnal dynameg celloedd a chyfanrwydd mitocondriaidd trwy apoptosis, mitoffagiaeth a hirhoedledd yn yr afu. Dangosodd ein data fod dau enyn yn gyffredin ar draws y tri phrawf: YKT6 ac AKT1. Mae'n werth nodi bod YKT6 yn brotein SNARE sy'n rhan o'r broses o uno pilen gell. Mae'n chwarae rhan mewn awtoffagiaeth a mitoffagiaeth trwy ffurfio cymhlyg cychwyn gyda STX17 a SNAP29 ar yr awtoffagosom, a thrwy hynny hyrwyddo uno awtoffagosomau a lysosomau[35]. Ar ben hynny, mae colli swyddogaeth YKT6 yn arwain at nam ar mitoffagiaeth[36], tra bod uwchreoleiddio YKT6 yn gysylltiedig â datblygiad carsinoma hepatocellwlaidd (HCC), gan ddangos cynnydd mewn goroesiad celloedd[37]. Ar y llaw arall, AKT1 yw'r genyn rhyngweithiol pwysicaf ac mae'n chwarae rhan bwysig mewn clefydau'r afu, gan gynnwys llwybr signalau PI3K/AKT, cylchred celloedd, mudo celloedd, amlhau, adlyniad ffocal, swyddogaeth mitocondriaidd, a secretiad colagen[38–40]. Gall llwybr signalau PI3K/AKT wedi'i actifadu actifadu celloedd bonyn hematopoietig (HSCs), sef y celloedd sy'n gyfrifol am gynhyrchu matrics allgellog (ECM), a gall ei gamreoleiddio gyfrannu at ddigwyddiad a datblygiad ffibrosis yr afu[40]. Yn ogystal, mae AKT yn un o'r ffactorau goroesiad celloedd allweddol sy'n atal apoptosis celloedd sy'n ddibynnol ar p53, a gall actifadu AKT fod yn gysylltiedig ag atal apoptosis celloedd yr afu[41, 42]. Mae'r canlyniadau a gafwyd yn awgrymu y gallai IPA fod yn rhan o apoptosis sy'n gysylltiedig â mitochondria'r afu trwy effeithio ar benderfyniad hepatocytau rhwng mynd i mewn i apoptosis neu oroesi. Gall yr effeithiau hyn gael eu rheoleiddio gan enynnau ymgeisydd AKT a/neu YKT6, sy'n hanfodol ar gyfer homeostasis yr afu.
Dangosodd ein canlyniadau fod 1 mM IPA wedi achosi apoptosis a lleihau resbiradaeth mitocondriaidd mewn celloedd LX-2 yn annibynnol ar driniaeth TGF-β1. Mae'n werth nodi bod apoptosis yn llwybr pwysig ar gyfer datrys ffibrosis ac actifadu celloedd bonyn hematopoietig (HSC), ac mae hefyd yn ddigwyddiad allweddol yn yr ymateb ffisiolegol gwrthdroadwy i ffibrosis yr afu [4, 43]. Ar ben hynny, rhoddodd adfer BHI mewn celloedd LX-2 ar ôl triniaeth gyfuniad fewnwelediadau newydd i rôl bosibl IPA wrth reoleiddio bio-ynni mitocondriaidd. O dan amodau gorffwys ac anactif, mae celloedd hematopoietig fel arfer yn defnyddio ffosfforyleiddiad ocsideiddiol mitocondriaidd i gynhyrchu ATP ac mae ganddynt weithgaredd metabolaidd isel. Ar y llaw arall, mae actifadu HSC yn gwella resbiradaeth a biosynthesis mitocondriaidd i wneud iawn am y gofynion ynni o fynd i mewn i'r cyflwr glycolytig [44]. Mae'r ffaith nad oedd IPA yn effeithio ar botensial metabolaidd ac ECAR yn awgrymu bod y llwybr glycolytig yn cael llai o flaenoriaeth. Yn yr un modd, dangosodd astudiaeth arall fod 1 mM IPA yn gallu modiwleiddio gweithgaredd cadwyn resbiradol mitocondriaidd mewn cardiomyocytes, llinell gelloedd hepatocyte dynol (Huh7) a chelloedd endothelaidd gwythiennau bogail dynol (HUVEC); Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw effaith IPA ar glycolysis mewn cardiomyocytes, gan awgrymu y gallai IPA effeithio ar fio-egnïaeth mathau eraill o gelloedd [45]. Felly, rydym yn dyfalu y gallai 1 mM IPA weithredu fel dadgysylltydd cemegol ysgafn, gan y gall leihau mynegiant genynnau ffibrogenig, morffoleg celloedd a bio-egnïaeth mitocondriaidd yn sylweddol heb newid faint o mtDNA [46]. Gall dadgysylltwyr mitocondriaidd atal ffibrosis a achosir gan ddiwylliant ac actifadu HSC [47] a lleihau cynhyrchiad ATP mitocondriaidd a reoleiddir neu a achosir gan broteinau penodol fel proteinau dadgysylltiedig (UCP) neu drawslocas niwcleotid adenin (ANT). Yn dibynnu ar y math o gell, gall y ffenomen hon amddiffyn celloedd rhag apoptosis a/neu hyrwyddo apoptosis [46]. Fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach i egluro rôl IPA fel dadgysylltydd mitocondriaidd mewn anactifadu celloedd bonyn hematopoietig.
Yna fe wnaethom ymchwilio i weld a yw'r newidiadau mewn resbiradaeth mitocondriaidd yn cael eu hadlewyrchu mewn morffoleg mitocondriaidd mewn celloedd LX-2 byw. Yn ddiddorol, mae triniaeth TGF-β1 yn newid cyfran y mitocondriaidd o sfferig i ganolig, gyda changhennu mitocondriaidd is a mynegiant cynyddol o DRP1, ffactor allweddol mewn ymholltiad mitocondriaidd [48]. Ar ben hynny, mae darnio mitocondriaidd yn gysylltiedig â chymhlethdod rhwydwaith cyffredinol, ac mae'r newid o gyfuno i ymholltiad yn hanfodol ar gyfer actifadu celloedd bonyn hematopoietig (HSC), tra bod atal ymholltiad mitocondriaidd yn arwain at apoptosis HSC [49]. Felly, mae ein canlyniadau'n dangos y gall triniaeth TGF-β1 achosi gostyngiad yng nghymhlethdod rhwydwaith mitocondriaidd gyda changhennu is, sy'n fwy cyffredin mewn ymholltiad mitocondriaidd sy'n gysylltiedig â chelloedd bonyn hematopoietig wedi'u actifadu (HSCs). Ar ben hynny, dangosodd ein data y gallai IPA newid cyfran y mitocondriaidd o siâp sfferig i siâp canolig, a thrwy hynny leihau mynegiant OPA1 ac MFN2. Mae astudiaethau wedi dangos y gallai lleihau OPA1 achosi gostyngiad ym mhotensial pilen mitocondriaidd a sbarduno apoptosis celloedd [50]. Mae'n hysbys bod MFN2 yn cyfryngu cyfuniad mitocondriaidd ac apoptosis [51]. Mae'r canlyniadau a gafwyd yn awgrymu bod ysgogi celloedd LX-2 gan TGF-β1 a/neu IPA i bob golwg yn modiwleiddio siâp a maint mitocondriaidd, yn ogystal â chyflwr actifadu a chymhlethdod y rhwydwaith.
Mae ein canlyniadau'n dangos y gallai'r driniaeth gyfunol o TGFβ-1 ac IPA leihau paramedrau morffolegol mtDNA a chelloedd trwy reoleiddio mynegiant mRNA genynnau sy'n gysylltiedig â ffibrosis, apoptosis a goroesiad mewn celloedd sy'n osgoi apoptosis. Yn wir, gostyngodd IPA lefel mynegiant mRNA AKT1 a genynnau ffibrosis pwysig fel COL1A2 a MMP2, ond cynyddodd lefel mynegiant CASP8, sy'n gysylltiedig ag apoptosis. Dangosodd ein canlyniadau, ar ôl triniaeth IPA, fod mynegiant BAX wedi gostwng a bod mynegiant mRNA is-unedau teulu TIMP1, BCL-2 ac NF-κB wedi cynyddu, gan awgrymu y gallai IPA ysgogi signalau goroesiad mewn celloedd bonyn hematopoietig (HSCs) sy'n osgoi apoptosis. Gall y moleciwlau hyn weithredu fel signalau pro-oroesiad mewn celloedd bonyn hematopoietig wedi'u actifadu, a all fod yn gysylltiedig â mynegiant cynyddol proteinau gwrth-apoptotig (fel Bcl-2), mynegiant gostyngedig o BAX pro-apoptotig, a rhyngweithio cymhleth rhwng TIMP ac NF-κB [5, 7]. Mae IPA yn cael ei effeithiau drwy PXR, a gwelsom fod triniaeth gyfunol â TGF-β1 ac IPA wedi cynyddu lefelau mynegiant mRNA PXR, sy'n dangos atal actifadu HSC. Gwyddys bod signalau PXR wedi'u actifadu yn atal actifadu HSC in vivo ac in vitro [52, 53]. Mae ein canlyniadau'n dangos y gall IPA gymryd rhan yn y broses o glirio HSCs wedi'u actifadu drwy hyrwyddo apoptosis, lleihau ffibrosis a metaboledd mitocondriaidd, a gwella signalau goroesi, sef prosesau nodweddiadol sy'n trosi'r ffenoteip HSC wedi'i actifadu i un anactifadu. Esboniad posibl arall ar gyfer y mecanwaith a rôl bosibl o IPA mewn apoptosis yw ei fod yn chwilota mitochondria camweithredol yn bennaf drwy mitoffagiaeth (llwybr mewnol) a'r llwybr signalau TNF allanol (Tabl 1), sy'n gysylltiedig yn uniongyrchol â'r llwybr signalau goroesi NF-κB (Ffigur Atodol 7). Yn ddiddorol, mae genynnau cyfoethog sy'n gysylltiedig ag IPA yn gallu ysgogi signalau pro-apoptotig a pro-oroesi yn y llwybr apoptotig [54], gan awgrymu y gall IPA ysgogi'r llwybr apoptotig neu oroesi drwy ryngweithio â'r genynnau hyn. Fodd bynnag, mae sut mae IPA yn achosi apoptosis neu oroesiad yn ystod actifadu HSC a'i lwybrau mecanyddol yn parhau i fod yn aneglur.
Mae IPA yn fetabolit microbaidd a ffurfir o tryptophan dietegol trwy ficrobiota'r perfedd. Mae astudiaethau wedi dangos bod ganddo briodweddau gwrthlidiol, gwrthocsidiol, ac epigenetig rheoleiddiol yn yr amgylchedd berfeddol.[55] Mae astudiaethau wedi dangos y gall IPA addasu swyddogaeth rhwystr berfeddol a lleihau straen ocsideiddiol, a all gyfrannu at ei effeithiau ffisiolegol lleol.[56] Mewn gwirionedd, mae IPA yn cael ei gludo i organau targed trwy'r cylchrediad, a chan fod IPA yn rhannu strwythur metabolit mawr tebyg â tryptophan, serotonin, ac deilliadau indole, mae IPA yn arfer gweithredoedd metabolaidd gan arwain at dyngedau metabolaidd cystadleuol.[52] Gall IPA gystadlu â metabolion sy'n deillio o tryptophan am safleoedd rhwymo ar ensymau neu dderbynyddion, gan amharu ar lwybrau metabolaidd arferol o bosibl. Mae hyn yn tynnu sylw at yr angen am astudiaethau pellach ar ei ffarmacodynameg a'i ffarmacodynameg i ddeall ei ffenestr therapiwtig yn well.[57] Mae'n parhau i fod i'w weld a all hyn ddigwydd hefyd mewn celloedd bonyn hematopoietig (HSCs).
Rydym yn cydnabod bod gan ein hastudiaeth rai cyfyngiadau. Er mwyn archwilio cysylltiadau sy'n gysylltiedig ag IPA yn benodol, fe wnaethom eithrio cleifion â diabetes mellitus math 2 (T2DM). Rydym yn cydnabod bod hyn yn cyfyngu ar gymhwysedd eang ein canfyddiadau i gleifion â diabetes mellitus math 2 a chlefyd datblygedig yr afu. Er bod crynodiad ffisiolegol IPA mewn serwm dynol yn 1–10 μM [11, 20], dewiswyd crynodiad o 1 mM IPA yn seiliedig ar y crynodiad diwenwyn uchaf [15] a'r gyfradd uchaf o apoptosis, heb unrhyw wahaniaeth yng nghanran y boblogaeth celloedd necrotig. Er bod lefelau uwchffisiolegol o IPA wedi'u defnyddio yn yr astudiaeth hon, nid oes consensws ar hyn o bryd ynghylch y dos effeithiol o IPA [52]. Er bod ein canlyniadau'n arwyddocaol, mae tynged metabolig ehangach IPA yn parhau i fod yn faes ymchwil gweithredol. Ar ben hynny, cafwyd ein canfyddiadau ar y cysylltiad rhwng lefelau IPA serwm a methyliad DNA trawsgrifiadau'r afu nid yn unig o gelloedd bonyn hematopoietig (HSCs) ond hefyd o feinweoedd yr afu. Dewisom ddefnyddio celloedd LX-2 dynol yn seiliedig ar ein canfyddiadau blaenorol o ddadansoddiad transcriptome bod IPA yn gysylltiedig ag actifadu celloedd bonyn hematopoietig (HSC) [15], a HSCs yw'r prif gelloedd sy'n ymwneud â datblygiad ffibrosis yr afu. Mae'r afu yn cynnwys sawl math o gell, felly dylid ystyried modelau celloedd eraill megis system gyd-ddiwylliant celloedd hepatocyte-HSC-imiwnedd ynghyd ag actifadu caspase a darnio DNA yn ogystal â'r mecanwaith gweithredu gan gynnwys lefel protein i astudio rôl IPA a'i ryngweithio â mathau eraill o gelloedd yr afu.