Mae'r erthygl yn rhan o'r pwnc ymchwil “Gwella ymwrthedd codlysiau i bathogenau a phlâu”, gweler pob un o'r 5 erthygl
Mae'r asiant achosol ar gyfer necrosis y clefyd planhigion ffwngaidd Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary yn defnyddio strategaeth aml-haen i heintio gwahanol blanhigion gwesteiwr. Mae'r astudiaeth hon yn cynnig defnyddio'r diamin L-ornithine, asid amino nad yw'n brotein sy'n ysgogi synthesis asidau amino hanfodol eraill, fel strategaeth reoli amgen i wella ymatebion moleciwlaidd, ffisiolegol a biocemegol Phaseolus vulgaris L. i fowld gwyn a achosir gan Pseudomonas sclerotiorum. Dangosodd arbrofion in vitro fod L-ornithine wedi atal twf mycelial S. pyrenoidosa yn sylweddol mewn modd sy'n ddibynnol ar ddos. Ar ben hynny, gallai leihau difrifoldeb mowld gwyn yn sylweddol o dan amodau tŷ gwydr. Ar ben hynny, ysgogodd L-ornithine dwf y planhigion a gafodd eu trin, gan ddangos nad oedd y crynodiadau a brofwyd o L-ornithine yn ffytowensig i'r planhigion a gafodd eu trin. Yn ogystal, fe wnaeth L-ornithine wella mynegiant gwrthocsidyddion anensymatig (ffenolau a flavonoidau hydawdd cyfan) a gwrthocsidyddion ensymatig (catalase (CAT), peroxidase (POX), a polyphenol oxidase (PPO)), a chynyddu mynegiant tri gen sy'n gysylltiedig â gwrthocsidyddion (PvCAT1, PvSOD, a PvGR). Ar ben hynny, datgelodd dadansoddiad in silico bresenoldeb protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) tybiedig yng ngenom S. sclerotiorum, a oedd yn debyg iawn i broteinau oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) a Penicillium sp. (PlOAH) o ran dadansoddiad swyddogaethol, parthau cadwedig, a thopoleg. Yn ddiddorol, gostyngodd ychwanegu L-ornithine at gyfrwng cawl dextros tatws (PDB) fynegiant y genyn SsOAH yn sylweddol ym mycelia S. sclerotiorum. Yn yr un modd, gostyngodd rhoi L-ornithin alldarddol fynegiant y genyn SsOAH yn sylweddol mewn mycelia ffwngaidd a gasglwyd o blanhigion wedi'u trin. Yn olaf, gostyngodd rhoi L-ornithin y secretiad asid ocsalig yn sylweddol mewn cyfrwng PDB a dail heintiedig. I gloi, mae L-ornithin yn chwarae rhan allweddol wrth gynnal y statws redoks yn ogystal â gwella ymateb amddiffynnol planhigion heintiedig. Gall canlyniadau'r astudiaeth hon helpu i ddatblygu dulliau arloesol, sy'n gyfeillgar i'r amgylchedd i reoli llwydni gwyn a lliniaru ei effaith ar gynhyrchu ffa a chnydau eraill.
Mae llwydni gwyn, a achosir gan y ffwng necrotroffig Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, yn glefyd dinistriol sy'n lleihau cynnyrch ac sy'n peri bygythiad difrifol i gynhyrchu ffa (Phaseolus vulgaris L.) byd-eang (Bolton et al., 2006). Mae Sclerotinia sclerotiorum yn un o'r pathogenau planhigion ffwngaidd anoddaf i'w reoli, gydag ystod eang o dros 600 o rywogaethau planhigion a'r gallu i faddau meinweoedd y gwesteiwr yn gyflym mewn modd amhenodol (Liang a Rollins, 2018). O dan amodau anffafriol, mae'n mynd trwy gyfnod hollbwysig o'i gylchred bywyd, gan aros yn segur am gyfnodau hir fel strwythurau du, caled, tebyg i hadau o'r enw 'sclerotia' yn y pridd neu fel tyfiannau gwyn, blewog yn y myceliwm neu drwyn coesyn planhigion heintiedig (Schwartz et al., 2005). Mae S. sclerotiorum yn gallu ffurfio sclerotia, sy'n caniatáu iddo oroesi mewn caeau heintiedig am gyfnodau hir ac i barhau yn ystod clefyd (Schwartz et al., 2005). Mae sclerotia yn gyfoethog mewn maetholion, gallant barhau yn y pridd am gyfnodau hir, a gwasanaethu fel y prif frechlyn ar gyfer heintiau dilynol (Schwartz et al., 2005). O dan amodau ffafriol, mae sclerotia yn egino ac yn cynhyrchu sborau yn yr awyr a all heintio pob rhan uwchben y ddaear o'r planhigyn, gan gynnwys ond heb fod yn gyfyngedig i flodau, coesynnau, neu godennau (Schwartz et al., 2005).
Mae Sclerotinia sclerotiorum yn defnyddio strategaeth aml-haen i heintio ei blanhigion gwesteiwr, sy'n cynnwys cyfres o ddigwyddiadau cydlynol o egino sclerotial i ddatblygiad symptomau. I ddechrau, mae S. sclerotiorum yn cynhyrchu sborau crog (a elwir yn asgosporau) o strwythurau tebyg i fadarch o'r enw apothecia, sy'n dod yn yr awyr ac yn datblygu'n sclerotia ansymudol ar falurion planhigion heintiedig (Bolton et al., 2006). Yna mae'r ffwng yn secretu asid ocsalig, ffactor firwleiddiad, i reoli pH wal gell planhigion, hyrwyddo diraddio ensymatig a goresgyniad meinwe (Hegedus a Rimmer, 2005), ac atal ffrwydrad ocsideiddiol y planhigyn gwesteiwr. Mae'r broses asideiddio hon yn gwanhau wal gell y planhigyn, gan ddarparu amgylchedd ffafriol ar gyfer gweithrediad arferol ac effeithlon ensymau diraddio wal gell ffwngaidd (CWDEs), gan ganiatáu i'r pathogen oresgyn y rhwystr ffisegol a threiddio meinweoedd y gwesteiwr (Marciano et al., 1983). Ar ôl iddo dreiddio, mae S. sclerotiorum yn secretu nifer o CWDEs, fel polygalacturonase a cellulase, sy'n hwyluso ei ledaeniad mewn meinweoedd heintiedig ac yn achosi necrosis meinwe. Mae dilyniant briwiau a matiau hyffa yn arwain at symptomau nodweddiadol llwydni gwyn (Hegedus a Rimmer, 2005). Yn y cyfamser, mae planhigion gwesteiwr yn adnabod patrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â pathogenau (PAMPs) trwy dderbynyddion adnabod patrymau (PRRs), gan sbarduno cyfres o ddigwyddiadau signalau sy'n y pen draw yn actifadu ymatebion amddiffyn.
Er gwaethaf degawdau o ymdrechion i reoli clefydau, mae prinder germplasm gwrthiannol digonol yn parhau mewn ffa, fel mewn cnydau masnachol eraill, oherwydd ymwrthedd, goroesiad ac addasrwydd y pathogen. Felly mae rheoli clefydau yn hynod heriol ac mae angen strategaeth integredig, amlochrog sy'n cynnwys cyfuniad o arferion diwylliannol, rheolaeth fiolegol a ffwngladdiadau cemegol (O'Sullivan et al., 2021). Rheoli llwydni gwyn yn gemegol yw'r mwyaf effeithiol oherwydd gall ffwngladdiadau, pan gânt eu rhoi'n gywir ac ar yr amser iawn, reoli lledaeniad y clefyd yn effeithiol, lleihau difrifoldeb yr haint a lleihau colledion cynnyrch. Fodd bynnag, gall gor-ddefnyddio a gor-ddibynnu ar ffwngladdiadau arwain at ymddangosiad rhywogaethau gwrthiannol o S. sclerotiorum ac effeithio'n negyddol ar organebau nad ydynt yn dargedau, iechyd y pridd ac ansawdd dŵr (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Felly, mae dod o hyd i ddewisiadau amgen sy'n gyfeillgar i'r amgylchedd wedi dod yn flaenoriaeth uchel.
Gall polyaminau (PAs), fel putrescine, spermidine, spermine, a chadaverine, fod yn ddewisiadau amgen addawol yn erbyn pathogenau planhigion a gludir yn y pridd, a thrwy hynny leihau'r defnydd o ffwngladdiadau cemegol peryglus yn llwyr neu'n rhannol (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Mewn planhigion uwch, mae PAs yn ymwneud â llawer o brosesau ffisiolegol gan gynnwys, ond heb fod yn gyfyngedig i, rhaniad celloedd, gwahaniaethu, ac ymateb i straen abiotig a biotig (Killiny a Nehela, 2020). Gallant weithredu fel gwrthocsidyddion, helpu i gasglu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), cynnal homeostasis redoks (Nehela a Killiny, 2023), ysgogi genynnau sy'n gysylltiedig ag amddiffyn (Romero et al., 2018), rheoleiddio amrywiol lwybrau metabolaidd (Nehela a Killiny, 2023), modiwleiddio ffytohormonau mewndarddol (Nehela a Killiny, 2019), sefydlu ymwrthedd systemig a gafwyd (SAR), a rheoleiddio rhyngweithiadau planhigion-pathogenau (Nehela a Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Mae'n werth nodi bod y mecanweithiau a'r rolau penodol o PAs mewn amddiffyn planhigion yn amrywio yn dibynnu ar rywogaethau planhigion, pathogenau, ac amodau amgylcheddol. Mae'r PA mwyaf niferus mewn planhigion yn cael ei biosyntheseiddio o'r polyamin hanfodol L-ornithine (Killiny a Nehela, 2020).
Mae L-ornithine yn chwarae sawl rôl mewn twf a datblygiad planhigion. Er enghraifft, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall ornithine fod yn gysylltiedig ag ailgylchu nitrogen (Liu et al., 2018), cynnyrch reis, ansawdd ac arogl (Lu et al., 2020), ac ymateb i straen dŵr (Yang et al., 2000) mewn reis (Oryza sativa). Ar ben hynny, fe wnaeth rhoi L-ornithine yn alldarddol wella goddefgarwch sychder yn sylweddol mewn betys siwgr (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) a lleddfu straen halen mewn planhigion nionyn (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu a Çavuşoǧlu, 2021) a chashiw (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Gall rôl bosibl L-ornithine mewn amddiffyn rhag straen abiotig fod oherwydd ei ran mewn cronni prolin mewn planhigion wedi'u trin. Er enghraifft, adroddwyd yn flaenorol bod genynnau sy'n gysylltiedig â metaboledd prolin, fel genynnau ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) a proline dehydrogenase (ProDH1 a ProDH2), yn rhan o amddiffyn Nicotiana benthamiana ac Arabidopsis thaliana yn erbyn straenau Pseudomonas syringae nad ydynt yn westeiwr (Senthil-Kumar a Mysore, 2012). Ar y llaw arall, mae angen ornithine decarboxylase ffwngaidd (ODC) ar gyfer twf pathogenau (Singh et al., 2020). Gwellodd targedu ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici trwy dawelu genynnau a achosir gan westeiwr (HIGS) wrthwynebiad planhigion tomato i wywo Fusarium yn sylweddol (Singh et al., 2020). Fodd bynnag, nid yw rôl bosibl rhoi ornithine alldarddol yn erbyn straen biotig fel ffytopathogenau wedi'i hastudio'n dda. Yn bwysicach fyth, mae effeithiau ornithine ar wrthwynebiad i glefydau a'r ffenomenau biocemegol a ffisiolegol cysylltiedig yn parhau i fod heb eu harchwilio i raddau helaeth.
Mae deall cymhlethdod haint S. sclerotiorum mewn codlysiau yn bwysig ar gyfer datblygu strategaethau rheoli effeithiol. Yn yr astudiaeth hon, ein nod oedd nodi rôl bosibl y diamin L-ornithine fel ffactor allweddol wrth wella mecanweithiau amddiffyn a gwrthwynebiad planhigion codlysiau i haint Sclerotinia sclerotiorum. Rydym yn rhagdybio, yn ogystal â gwella ymatebion amddiffyn planhigion heintiedig, bod L-ornithine hefyd yn chwarae rhan allweddol wrth gynnal y statws redoks. Rydym yn cynnig bod effeithiau posibl L-ornithine yn gysylltiedig â rheoleiddio mecanweithiau amddiffyn gwrthocsidiol ensymatig ac an-ensymatig ac ymyrraeth â ffactorau pathogenedd/firwlens ffwngaidd a phroteinau cysylltiedig. Mae'r swyddogaeth ddeuol hon o L-ornithine yn ei gwneud yn ymgeisydd addawol ar gyfer strategaeth gynaliadwy i liniaru effaith llwydni gwyn a gwella ymwrthedd cnydau codlysiau cyffredin i'r pathogen ffwngaidd cryf hwn. Gall canlyniadau'r astudiaeth bresennol helpu i ddatblygu dulliau arloesol, sy'n gyfeillgar i'r amgylchedd i reoli llwydni gwyn a lliniaru ei effaith ar gynhyrchu codlysiau.
Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd amrywiaeth fasnachol agored i niwed o ffa cyffredin, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), fel deunydd arbrofol. Darparwyd hadau iach yn garedig gan yr Adran Ymchwil Codlysiau, Sefydliad Ymchwil Cnydau Maes (FCRI), Canolfan Ymchwil Amaethyddol (ARC), yr Aifft. Heuwyd pum had mewn potiau plastig (diamedr mewnol 35 cm, dyfnder 50 cm) wedi'u llenwi â phridd wedi'i heintio â S. sclerotiorum o dan amodau tŷ gwydr (25 ± 2 °C, lleithder cymharol 75 ± 1%, 8 awr o olau/16 awr o dywyllwch). Ar 7–10 diwrnod ar ôl hau (DPS), teneuwyd yr eginblanhigion i adael dim ond dau eginblanhigyn â thwf unffurf a thair dail wedi ehangu'n llawn ym mhob pot. Dyfrhawyd yr holl blanhigion mewn pot unwaith bob pythefnos a'u ffrwythloni'n fisol ar y gyfradd a argymhellir ar gyfer yr amrywiaeth benodol.
I baratoi crynodiad o 500 mg/L o L-ornithinediamine (a elwir hefyd yn asid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, yr Almaen), diddymwyd 50 mg yn gyntaf mewn 100 mL o ddŵr distyll di-haint. Yna gwanhawyd y toddiant stoc a'i ddefnyddio mewn arbrofion dilynol. Yn gryno, profwyd chwe chyfres o grynodiadau L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, a 125 mg/L) in vitro. Yn ogystal, defnyddiwyd dŵr distyll di-haint fel rheolaeth negyddol (Mock) a defnyddiwyd ffwngladdiad masnachol “Rizolex-T” powdr gwlybadwy 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Llywodraethiaeth Gharbia, yr Aifft) fel rheolaeth bositif. Profwyd y ffwngladdiad masnachol “Rizolex-T” in vitro ar bum crynodiad (2, 4, 6, 8 a 10 mg/L).
Casglwyd samplau o goesynnau a chodennau ffa cyffredin yn dangos symptomau nodweddiadol llwydni gwyn (cyfradd haint: 10–30%) o ffermydd masnachol. Er bod y rhan fwyaf o'r deunyddiau planhigion heintiedig wedi'u hadnabod yn ôl rhywogaeth/amrywiaeth (amrywiaeth fasnachol agored i niwed Giza 3), roedd eraill, yn enwedig y rhai a gafwyd o farchnadoedd lleol, o rywogaethau anhysbys. Cafodd y deunyddiau heintiedig a gasglwyd eu diheintio arwyneb yn gyntaf gyda hydoddiant sodiwm hypoclorit 0.5% am 3 munud, yna eu rinsio sawl gwaith gyda dŵr distyll di-haint a'u sychu'n sych gyda phapur hidlo di-haint i gael gwared ar ddŵr gormodol. Yna torrwyd yr organau heintiedig yn ddarnau bach o'r meinwe ganol (rhwng meinweoedd iach a heintiedig), eu meithrin ar gyfrwng agar dextros tatws (PDA) a'u magu ar 25 ± 2 °C gyda chylchred golau 12 awr/tywyllwch 12 awr am 5 diwrnod i ysgogi ffurfio sclerotia. Defnyddiwyd y dull blaen mycelial hefyd i buro ynysyddion ffwngaidd o ddiwylliannau cymysg neu halogedig. Nodwyd yr ynysydd ffwngaidd wedi'i buro yn gyntaf yn seiliedig ar ei nodweddion morffolegol diwylliannol ac yna cadarnhawyd ei fod yn S. sclerotiorum yn seiliedig ar nodweddion microsgopig. Yn olaf, profwyd yr holl ynysyddion wedi'u puro am bathogenedd ar y cyltifar ffa cyffredin agored i niwed Giza 3 i fodloni rhagdybiaethau Koch.
Yn ogystal, cadarnhawyd ymhellach yr ynysolyn S. sclerotiorum mwyaf ymledol (ynysolyn #3) yn seiliedig ar ddilyniannu bylchwr trawsgrifiedig mewnol (ITS) fel y'i disgrifiwyd gan White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Yn gryno, diwylliwyd ynysolion mewn cawl dextros tatws (PDB) a'u magu ar 25 ± 2 °C am 5–7 diwrnod. Yna casglwyd myceliwm ffwngaidd, ei hidlo trwy frethyn caws, ei olchi ddwywaith â dŵr di-haint, a'i sychu â phapur hidlo di-haint. Ynyswyd DNA genomig gan ddefnyddio'r Pecyn Miniprep Ffwngaidd/Bacteriol Quick-DNA™ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Yna cafodd rhanbarth rDNA ITS ei fwyhau gan ddefnyddio'r pâr primer penodol ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; maint disgwyliedig: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Cyflwynwyd y cynhyrchion PCR wedi'u puro i'w dilyniannu (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Cafodd dilyniannau rDNA ITS eu dilyniannu'n ddwyffordd gan ddefnyddio dull dilyniannu Sanger. Yna cymharwyd y dilyniannau ymholiad a gasglwyd â'r data diweddaraf yn GenBank a'r Ganolfan Genedlaethol ar gyfer Gwybodaeth Biotechnoleg (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) gan ddefnyddio meddalwedd BLASTn. Cymharwyd y dilyniant ymholiad â 20 o straeniau/ynysyddion S. sclerotiorum eraill a gafwyd o'r data diweddaraf yn NCBI GenBank (Tabl Atodol S1) gan ddefnyddio ClustalW yn y Pecyn Dadansoddi Geneteg Esblygiadol Moleciwlaidd (MEGA-11; fersiwn 11) (Kumar et al., 2024). Perfformiwyd dadansoddiad esblygiadol gan ddefnyddio'r dull tebygolrwydd mwyaf a'r model amnewid niwcleotid amser-gwrthdroadwy cyffredinol (Nei a Kumar, 2000). Dangosir y goeden gyda'r tebygolrwydd log uchaf. Dewisir y goeden gychwynnol ar gyfer y chwiliad hewristig trwy ddewis y goeden gyda'r tebygolrwydd log uwch rhwng y goeden ymuno â chymdogion (NJ) (Kumar et al., 2024) a'r goeden parsimoni mwyaf (MP). Adeiladwyd y goeden NJ gan ddefnyddio matrics pellter pâr a gyfrifwyd gan ddefnyddio'r model amser-gwrthdroadwy cyffredinol (Nei a Kumar, 2000).
Penderfynwyd gweithgaredd gwrthfacteria L-ornithine a'r bactericid “Rizolex-T” in vitro gan ddefnyddio'r dull trylediad agar. Dull: Cymerwch y swm priodol o'r toddiant stoc o L-ornithine (500 mg/L) a'i gymysgu'n drylwyr â 10 ml o'r cyfrwng maetholion PDA i baratoi toddiannau gyda chrynodiadau terfynol o 12.5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/L, yn y drefn honno. Defnyddiwyd pum crynodiad o'r ffwngleiddiad “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 a 10 mg/L) a dŵr distyll di-haint fel rheolydd. Ar ôl i'r cyfrwng galedu, trosglwyddwyd plwg myceliwm newydd ei baratoi o ddiwylliant Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm mewn diamedr, i ganol y ddysgl Petri a'i drin ar 25±2°C nes bod y myceliwm wedi gorchuddio'r ddysgl Petri reoli gyfan, ac ar ôl hynny cofnodwyd twf y ffwng. Cyfrifwch ganran yr ataliad o dwf rheiddiol S. sclerotiorum gan ddefnyddio hafaliad 1:
Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith, gyda chwe dyblygiad biolegol ar gyfer pob grŵp rheoli/arbrofol a phum pot (dau blanhigyn fesul pot) ar gyfer pob dyblygiad biolegol. Dadansoddwyd pob dyblygiad biolegol ddwywaith (dau ddyblygiad technegol) i sicrhau cywirdeb, dibynadwyedd ac atgynhyrchadwyedd y canlyniadau arbrofol. Yn ogystal, defnyddiwyd dadansoddiad atchweliad probit i gyfrifo'r crynodiad ataliol hanner-uchaf (IC50) ac IC99 (Prentice, 1976).
I werthuso potensial L-ornithine o dan amodau tŷ gwydr, cynhaliwyd dau arbrawf pot olynol. Yn gryno, llenwyd potiau â phridd clai-tywod wedi'i sterileiddio (3:1) a'u brechu â diwylliant newydd ei baratoi o S. sclerotiorum. Yn gyntaf, diwylliwyd yr ynysydd mwyaf ymledol o S. sclerotiorum (ynysydd #3) trwy dorri un sclerotiwm yn ei hanner, ei osod wyneb i lawr ar PDA a'i ddeori ar 25°C mewn tywyllwch cyson (24 awr) am 4 diwrnod i ysgogi twf myceliwm. Yna cymerwyd pedwar plyg agar 5 mm o ddiamedr o'r ymyl flaen a'u brechu â 100 g o gymysgedd di-haint o fran gwenith a reis (1:1, v/v) a deorwyd yr holl fflasgiau ar 25 ± 2 °C o dan gylchred golau 12 awr/tywyllwch 12 awr am 5 diwrnod i ysgogi ffurfio sclerotia. Cymysgwyd cynnwys yr holl fflasgiau'n drylwyr i sicrhau homogenedd cyn ychwanegu pridd. Yna, ychwanegwyd 100 g o'r cymysgedd bran gwladychu i bob pot i sicrhau crynodiad cyson o bathogenau. Dyfrhawyd y potiau a frechwyd i actifadu twf ffwngaidd a'u rhoi mewn amodau tŷ gwydr am 7 diwrnod.
Yna heuwyd pum had o'r amrywiaeth Giza 3 ym mhob pot. Ar gyfer y potiau a gafodd eu trin ag L-ornithine a'r ffwngladdiad Rizolex-T, cafodd yr hadau wedi'u sterileiddio eu socian am ddwy awr yn gyntaf mewn toddiant dyfrllyd o'r ddau gyfansoddyn gyda chrynodiad IC99 terfynol o tua 250 mg/L a 50 mg/L, yn y drefn honno, ac yna eu sychu yn yr awyr am awr cyn hau. Ar y llaw arall, cafodd yr hadau eu socian mewn dŵr distyll di-haint fel rheolaeth negyddol. Ar ôl 10 diwrnod, cyn y dyfrio cyntaf, teneuwyd yr eginblanhigion, gan adael dim ond dau eginblanhigyn taclus ym mhob pot. Yn ogystal, er mwyn sicrhau haint â S. sclerotiorum, torrwyd coesynnau planhigion ffa yn yr un cyfnod datblygu (10 diwrnod) mewn dau leoliad gwahanol gan ddefnyddio scalpel wedi'i sterileiddio a gosodwyd tua 0.5 g o'r cymysgedd bran gwladychu ym mhob clwyf, ac yna lleithder uchel i ysgogi haint a datblygiad clefydau ym mhob planhigyn a frechwyd. Cafodd planhigion rheoli eu hanafu'n debyg a gosodwyd swm cyfartal (0.5 g) o gymysgedd bran di-haint, heb ei wladychu yn y clwyf a'i gynnal o dan leithder uchel i efelychu'r amgylchedd ar gyfer datblygiad clefydau a sicrhau cysondeb rhwng grwpiau triniaeth.
Dull triniaeth: Dyfrhawyd eginblanhigion ffa gyda 500 ml o doddiant dyfrllyd o L-ornithine (250 mg/l) neu'r ffwngladdiad Rizolex-T (50 mg/l) trwy ddyfrhau'r pridd, yna ailadroddwyd y driniaeth dair gwaith ar gyfnod o 10 diwrnod. Dyfrhawyd y rheolyddion a gafodd driniaeth plasebo gyda 500 ml o ddŵr distyll di-haint. Cynhaliwyd yr holl driniaethau o dan amodau tŷ gwydr (25 ± 2°C, 75 ± 1% lleithder cymharol, a ffotogyfnod o 8 awr o olau/16 awr o dywyllwch). Dyfrhawyd yr holl botiau bob pythefnos a'u trin yn fisol gyda gwrtaith NPK cytbwys (20-20-20, gyda 3.6% o sylffwr a microelfennau TE; Zain Seeds, Yr Aifft) ar grynodiad o 3–4 g/l trwy chwistrellu deiliach yn unol â'r argymhellion ar gyfer yr amrywiaeth benodol a chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Oni nodir yn wahanol, casglwyd dail aeddfed wedi ehangu'n llawn (2il a 3ydd dail o'r brig) o bob dyblygiad biolegol 72 awr ar ôl y driniaeth (hpt), eu homogeneiddio, eu cronni a'u storio ar -80 °C ar gyfer dadansoddiadau pellach gan gynnwys, ond heb fod yn gyfyngedig i, lleoliad histochemegol in situ dangosyddion straen ocsideiddiol, perocsidiad lipid, gwrthocsidyddion ensymatig ac anensymatig a mynegiant genynnau.
Aseswyd dwyster haint llwydni gwyn yn wythnosol 21 diwrnod ar ôl y brechiad (dpi) gan ddefnyddio graddfa o 1–9 (Tabl Atodol S2) yn seiliedig ar raddfa Petzoldt a Dickson (1996) a addaswyd gan Teran et al. (2006). Yn gryno, archwiliwyd coesynnau a changhennau planhigion ffa gan ddechrau ar y pwynt brechu i ddilyn dilyniant briwiau ar hyd internodau a nodau. Yna mesurwyd pellter y briw o'r pwynt brechu i'r pwynt pellaf ar hyd y coesyn neu'r gangen a rhoddwyd sgôr o 1–9 yn seiliedig ar leoliad y briw, lle'r oedd (1) yn dynodi dim haint gweladwy ger y pwynt brechu a (2–9) yn dynodi cynnydd graddol ym maint a dilyniant y briw ar hyd nodau/internodau (Tabl Atodol S2). Yna troswyd dwyster haint llwydni gwyn yn ganran gan ddefnyddio fformiwla 2:
Yn ogystal, cyfrifwyd yr arwynebedd o dan y gromlin dilyniant clefyd (AUDPC) gan ddefnyddio'r fformiwla (Shaner a Finney, 1977), a addaswyd yn ddiweddar ar gyfer pydredd gwyn ffa cyffredin (Chauhan et al., 2020) gan ddefnyddio hafaliad 3:
Lle mae Yi = difrifoldeb y clefyd ar amser ti, Yi+1 = difrifoldeb y clefyd ar yr amser nesaf ti+1, ti = amser y mesuriad cyntaf (mewn dyddiau), ti+1 = amser y mesuriad nesaf (mewn dyddiau), n = cyfanswm nifer y pwyntiau amser neu bwyntiau arsylwi. Cofnodwyd paramedrau twf planhigion ffa gan gynnwys uchder y planhigyn (cm), nifer y canghennau fesul planhigyn, a nifer y dail fesul planhigyn yn wythnosol am 21 diwrnod ym mhob atgynhyrchiad biolegol.
Ym mhob dyblygiad biolegol, casglwyd samplau dail (yr ail a'r drydedd ddail wedi'u datblygu'n llawn o'r brig) ar ddiwrnod 45 ar ôl y driniaeth (15 diwrnod ar ôl y driniaeth olaf). Roedd pob dyblygiad biolegol yn cynnwys pum pot (dau blanhigyn fesul pot). Defnyddiwyd tua 500 mg o'r meinwe wedi'i falu ar gyfer echdynnu pigmentau ffotosynthetig (cloroffyl a, cloroffyl b a charotenoidau) gan ddefnyddio 80% aseton ar 4 °C yn y tywyllwch. Ar ôl 24 awr, cafodd y samplau eu centrifugio a chasglwyd yr uwchnofiant i bennu cynnwys cloroffyl a, cloroffyl b a charotenoidau yn colorimetrig gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) yn ôl dull (Lichtenthaler, 1987) trwy fesur yr amsugnedd ar dair tonfedd wahanol (A470, A646 ac A663 nm). Yn olaf, cyfrifwyd cynnwys pigmentau ffotosynthetig gan ddefnyddio'r fformwlâu canlynol 4–6 a ddisgrifiwyd gan Lichtenthaler (1987).
72 awr ar ôl y driniaeth (hpt), casglwyd dail (yr ail a'r drydedd ddail wedi'u datblygu'n llawn o'r brig) o bob dyblygiad biolegol ar gyfer lleoleiddio histochemegol hydrogen perocsid (H2O2) ac anion superocsid (O2•−) in situ. Roedd pob dyblygiad biolegol yn cynnwys pum pot (dau blanhigyn fesul pot). Dadansoddwyd pob dyblygiad biolegol yn ddyblyg (dau ddyblygiad technegol) i sicrhau cywirdeb, dibynadwyedd ac atgynhyrchadwyedd y dull. Penderfynwyd H2O2 ac O2•− gan ddefnyddio 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, yr Almaen) neu nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, yr Almaen), yn y drefn honno, gan ddilyn y dulliau a ddisgrifiwyd gan Romero-Puertas et al. (2004) ac Adam et al. (1989) gyda mân addasiadau. Ar gyfer lleoleiddio histochemegol H2O2 in situ, cafodd y taflenni eu treiddio dan wactod gyda 0.1% DAB mewn byffer Tris 10 mM (pH 7.8) ac yna eu deori ar dymheredd ystafell yn y golau am 60 munud. Cafodd y taflenni eu cannu mewn 0.15% (v/v) TCA mewn ethanol:clorofform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Yr Aifft) ac yna eu hamlygu i olau nes iddynt dywyllu. Yn yr un modd, cafodd y falfiau eu treiddio dan wactod gyda byffer ffosffad potasiwm 10 mM (pH 7.8) yn cynnwys 0.1 w/v % HBT ar gyfer lleoleiddio histochemegol O2•− in situ. Cafodd y taflenni eu deori yn y golau ar dymheredd ystafell am 20 munud, yna eu cannu fel uchod, ac yna eu goleuo nes bod smotiau glas tywyll/fioled yn ymddangos. Aseswyd dwyster y lliw brown (fel dangosydd H2O2) neu las-fioled (fel dangosydd O2•−) a ddeilliodd o hyn gan ddefnyddio fersiwn Fiji o'r pecyn prosesu delweddau ImageJ (http://fiji.sc; cyrchwyd 7 Mawrth 2024).
Penderfynwyd malondialdehyd (MDA; fel marcwr perocsidiad lipid) yn ôl dull Du a Bramlage (1992) gyda mân addasiadau. Casglwyd dail o bob dyblygiad biolegol (yr ail a'r drydedd ddail wedi'u datblygu'n llawn o'r brig) 72 awr ar ôl y driniaeth (hpt). Roedd pob dyblygiad biolegol yn cynnwys pum pot (dau blanhigyn fesul pot). Dadansoddwyd pob dyblygiad biolegol yn ddyblyg (dau ddyblygiad technegol) i sicrhau cywirdeb, dibynadwyedd ac atgynhyrchadwyedd y dull. Yn gryno, defnyddiwyd 0.5 g o feinwe dail wedi'i falu ar gyfer echdynnu MDA gyda 20% asid trichloroacetig (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, UDA) yn cynnwys 0.01% hydroxytoluene bwtylaidd (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA). Yna penderfynwyd cynnwys MDA yn yr uwchnofiant yn colorimetrig trwy fesur yr amsugnedd ar 532 a 600 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) ac yna mynegwyd ef fel nmol g−1 FW.
Ar gyfer asesu gwrthocsidyddion ensymatig ac anensymatig, casglwyd dail (yr ail a'r drydedd ddail wedi'u datblygu'n llawn o'r brig) o bob dyblygiad biolegol 72 awr ar ôl y driniaeth (hpt). Roedd pob dyblygiad biolegol yn cynnwys pum pot (dau blanhigyn fesul pot). Dadansoddwyd pob sampl fiolegol yn ddyblyg (dau sampl dechnegol). Malwyd dwy ddail â nitrogen hylifol a'u defnyddio'n uniongyrchol i bennu gwrthocsidyddion ensymatig ac anensymatig, cyfanswm asidau amino, cynnwys prolin, mynegiant genynnau, a meintioli ocsalad.
Penderfynwyd cyfanswm y ffenolau hydawdd gan ddefnyddio adweithydd Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) gyda mân addasiadau i'r dull a ddisgrifiwyd gan Kahkonen et al. (1999). Yn gryno, echdynnwyd tua 0.1 g o feinwe dail homogeneiddiedig gyda 20 ml o 80% methanol yn y tywyllwch am 24 awr a chasglwyd yr uwchnofiant ar ôl allgyrchu. Cymysgwyd 0.1 ml o'r dyfyniad sampl gyda 0.5 ml o adweithydd Folin-Ciocalteu (10%), ysgwyd am 30 eiliad a'i adael yn y tywyllwch am 5 munud. Yna ychwanegwyd 0.5 ml o doddiant sodiwm carbonad 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Yr Aifft) at bob tiwb, cymysgwyd yn drylwyr a'i ddeori ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch am 1 awr. Ar ôl deori, mesurwyd amsugnedd y cymysgedd adwaith ar 765 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Penderfynwyd crynodiad cyfanswm y ffenolau hydawdd yn y dyfyniadau sampl gan ddefnyddio cromlin calibradu asid galig (Fisher Scientific, Hampton, NH, UDA) a'i fynegi fel miligramau o gyfwerth asid galig fesul gram o bwysau ffres (mg GAE g-1 pwysau ffres).
Penderfynwyd cyfanswm cynnwys flavonoidau hydawdd yn ôl dull Djeridane et al. (2006) gyda mân addasiadau. Yn gryno, cymysgwyd 0.3 ml o'r dyfyniad methanol uchod â 0.3 ml o doddiant alwminiwm clorid 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, UDA), ei droi'n egnïol ac yna ei ddeori ar dymheredd ystafell am 5 munud, ac yna ychwanegu 0.3 ml o doddiant asetad potasiwm 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Yr Aifft), ei gymysgu'n drylwyr a'i ddeori ar dymheredd ystafell am 30 munud yn y tywyllwch. Ar ôl deori, mesurwyd amsugnedd y cymysgedd adwaith ar 430 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Penderfynwyd crynodiad cyfanswm y flavonoidau hydawdd mewn dyfyniad sampl gan ddefnyddio cromlin calibradu rutin (TCI America, Portland, OR, UDA) ac yna ei fynegi fel miligramau o gyfwerth rutin fesul gram o bwysau ffres (mg RE g-1 pwysau ffres).
Penderfynwyd cyfanswm cynnwys asid amino rhydd dail ffa gan ddefnyddio adweithydd ninhydrin wedi'i addasu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, UDA) yn seiliedig ar y dull a gynigiwyd gan Yokoyama a Hiramatsu (2003) ac a addaswyd gan Sun et al. (2006). Yn gryno, echdynnwyd 0.1 g o feinwe wedi'i falu gyda byffer pH 5.4, ac adweithiwyd 200 μL o'r uwchnofiant gyda 200 μL o ninhydrin (2%) a 200 μL o pyridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, UDA), ei ddeori mewn baddon dŵr berwedig am 30 munud, yna ei oeri a'i fesur ar 580 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Ar y llaw arall, penderfynwyd prolin gan ddefnyddio dull Bates (Bates et al., 1973). Echdynnwyd prolin gyda 3% asid sylffosalicylig (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, UDA) ac ar ôl allgyrchu, cymysgwyd 0.5 ml o'r uwchnofiant ag 1 ml o asid asetig rhewlifol (Fisher Scientific, Hampton, NH, UDA) ac adweithydd ninhydrin, ei ddeori ar 90°C am 45 munud, ei oeri a'i fesur ar 520 nm gan ddefnyddio'r un sbectroffotomedr ag uchod. Penderfynwyd cyfanswm yr asidau amino rhydd a'r prolin yn y darnau dail gan ddefnyddio cromliniau calibradu glysin a phrolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, UDA), yn y drefn honno, a'u mynegi fel mg/g o bwysau ffres.
I bennu gweithgaredd ensymatig ensymau gwrthocsidiol, echdynnwyd tua 500 mg o feinwe homogeneiddiedig gyda 3 ml o glustog Tris 50 mM (pH 7.8) yn cynnwys 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) a 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA), cafodd ei allgyrchu ar 10,000 × g am 20 munud o dan oergell (4 °C), a chasglwyd yr uwchnofiant (detholiad ensym crai) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Yna adweithiwyd Catalase (CAT) gyda 2 ml o byffer ffosffad sodiwm 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) a 100 μl o doddiant H2O2 269 mM i bennu ei weithgaredd ensymatig yn ôl dull Aebi (1984) gyda mân addasiadau (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Penderfynwyd gweithgaredd ensymatig perocsidase sy'n ddibynnol ar Guaiacol (POX) gan ddefnyddio dull Harrach et al. (2009). (2008) gyda mân addasiadau (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) a phenderfynwyd ar weithgaredd ensymatig polyffenol ocsidase (PPO) ar ôl adwaith â 2.2 ml o 100 mM o fwffer ffosffad sodiwm (pH 6.0), 100 μl o guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, UDA) a 100 μl o 12 mM H2O2. Addaswyd y dull ychydig o (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Perfformiwyd yr assay ar ôl adwaith â 3 ml o doddiant catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, UDA) (0.01 M) wedi'i baratoi'n ffres mewn 0.1 M o fwffer ffosffad (pH 6.0). Mesurwyd gweithgaredd CAT drwy fonitro dadelfennu H2O2 ar 240 nm (A240), mesurwyd gweithgaredd POX drwy fonitro'r cynnydd mewn amsugnedd ar 436 nm (A436), a mesurwyd gweithgaredd PPO drwy gofnodi amrywiadau amsugnedd ar 495 nm (A495) bob 30 eiliad am 3 munud gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160A (Shimadzu, Japan).
Defnyddiwyd RT-PCR amser real i ganfod lefelau trawsgrifiad tri genyn sy'n gysylltiedig â gwrthocsidyddion, gan gynnwys catalase peroxisomal (PvCAT1; Rhif Mynediad GenBank KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; Rhif Mynediad GenBank XM_068639556.1), a glutathione reductase (PvGR; Rhif Mynediad GenBank KY195009.1), mewn dail ffa (yr ail a'r drydedd ddail wedi'u datblygu'n llawn o'r brig) 72 awr ar ôl y driniaeth olaf. Yn gryno, ynyswyd RNA gan ddefnyddio Pecyn Echdynnu RNA Cyfanswm Simply P (Rhif Cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Tsieina) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Yna, syntheseiddiwyd cDNA gan ddefnyddio Pecyn Synthesis cDNA TOP script™ yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Rhestrir dilyniannau primer y tri genyn uchod yn Nhabl Atodol S3. Defnyddiwyd PvActin-3 (rhif mynediad GenBank: XM_068616709.1) fel y genyn cadw tŷ a chyfrifwyd y mynegiant genyn cymharol gan ddefnyddio'r dull 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001). Dangoswyd sefydlogrwydd actin o dan straen biotig (rhyngweithio anghydnaws rhwng codlysiau cyffredin a'r ffwng anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) a straen abiotig (sychder, halltedd, tymheredd isel) (Borges et al., 2012).
I ddechrau, fe wnaethom gynnal dadansoddiad in silico genom-gyfan o broteinau oxaloacetate asetylhydrolase (OAH) yn S. sclerotiorum gan ddefnyddio'r offeryn protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Yn gryno, fe wnaethom ddefnyddio OAH o Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; tacsid: 1191702; rhif mynediad GenBank XP_040799428.1; 342 asid amino) a Penicillium lagena (PlOAH; tacsid: 94218; rhif mynediad GenBank XP_056833920.1; 316 asid amino) fel dilyniannau ymholiad i fapio'r protein homologaidd yn S. sclerotiorum (tacsid: 5180). Perfformiwyd BLASTp yn erbyn y data genom S. sclerotiorum mwyaf diweddar sydd ar gael yn GenBank ar wefan y Ganolfan Genedlaethol ar gyfer Gwybodaeth Biotechnoleg (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Yn ogystal, casglwyd y genyn OAH a ragfynegwyd o S. sclerotiorum (SsOAH) a'r dadansoddiad esblygiadol a'r goeden ffylogenetig o AfOAH o A. fijiensis CBS 313.89 a PlOAH o P. lagena gan ddefnyddio'r dull tebygolrwydd mwyaf yn MEGA11 (Tamura et al., 2021) a'r model seiliedig ar fatrics JTT (Jones et al., 1992). Cyfunwyd y goeden ffylogenetig â'r dadansoddiad aliniad lluosog o ddilyniannau protein yr holl enynnau OAH a ragfynegwyd (SsOAH) o S. sclerotiorum a'r dilyniant ymholiad gan ddefnyddio'r Offeryn Aliniad Seiliedig ar Gyfyngiadau (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ac Agarwala, 2007). Yn ogystal, cafodd y dilyniannau asid amino gorau cyfatebol o SsOAH o S. sclerotiorum eu halinio â'r dilyniannau ymholiad (AfOAH a PlOAH) (Larkin et al., 2007) gan ddefnyddio ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), a chafodd rhanbarthau cadwedig yn yr aliniad eu delweddu gan ddefnyddio'r offeryn ESPript (fersiwn 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ar ben hynny, dosbarthwyd y parthau cynrychioliadol swyddogaethol a ragfynegwyd a'r safleoedd cadwedig o S. sclerotiorum SsOAH yn rhyngweithiol i wahanol deuluoedd gan ddefnyddio'r offeryn InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Yn olaf, perfformiwyd modelu strwythur tri dimensiwn (3D) o'r S. sclerotiorum SsOAH a ragfynegwyd gan ddefnyddio'r Protein Homology/Analogy Recognition Engine (gweinydd Phyre2 fersiwn 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) a'i ddilysu gan ddefnyddio'r gweinydd SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Cafodd y strwythurau tri dimensiwn a ragfynegwyd (fformat PDB) eu delweddu'n rhyngweithiol gan ddefnyddio'r pecyn UCSF-Chimera (fersiwn 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Defnyddiwyd PCR fflwroleuol amser real meintiol i bennu lefel drawsgrifio oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; rhif mynediad GenBank: XM_001590428.1) ym mycelia Sclerotinia sclerotiorum. Yn gryno, brechwyd S. sclerotiorum i fflasg yn cynnwys PDB a'i osod mewn deorydd ysgwyd (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, UDA) ar 25 ± 2 °C am 24 awr ar 150 rpm ac mewn tywyllwch cyson (24 awr) i ysgogi twf myceliwm. Wedi hynny, cafodd y celloedd eu trin ag L-ornithine a'r ffwngleiddiad Rizolex-T ar grynodiadau IC50 terfynol (tua 40 a 3.2 mg/L, yn y drefn honno) ac yna eu meithrin am 24 awr arall o dan yr un amodau. Ar ôl meithrin, cafodd y diwylliannau eu centrifugio ar 2500 rpm am 5 munud a chasglwyd yr uwchnofiant (myceliwm ffwngaidd) ar gyfer dadansoddi mynegiant genynnau. Yn yr un modd, casglwyd myceliwm ffwngaidd ar 0, 24, 48, 72, 96, a 120 awr ar ôl yr haint o blanhigion heintiedig a oedd wedi ffurfio llwydni gwyn a myceliwm cotwm ar wyneb meinweoedd heintiedig. Echdynnwyd RNA o'r myceliwm ffwngaidd ac yna syntheseiddiwyd cDNA fel y disgrifiwyd uchod. Rhestrir y dilyniannau primer ar gyfer SsOAH yn Nhabl Atodol S3. Defnyddiwyd SsActin (rhif mynediad GenBank: XM_001589919.1) fel y genyn cadw tŷ, a chyfrifwyd mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio'r dull 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001).
Penderfynwyd ar asid ocsalig mewn cawl dextros tatws (PDB) a samplau planhigion yn cynnwys y pathogen ffwngaidd Sclerotinia sclerotiorum yn ôl dull Xu a Zhang (2000) gyda mân addasiadau. Yn gryno, cafodd ynysyddion S. sclerotiorum eu brechu i fflasgiau yn cynnwys PDB ac yna eu meithrin mewn deorydd ysgwyd (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, UDA) ar 150 rpm ar 25 ± 2 °C am 3–5 diwrnod mewn tywyllwch cyson (24 awr) i ysgogi twf myceliwm. Ar ôl y deori, hidlwyd y diwylliant ffwngaidd yn gyntaf trwy bapur hidlo Whatman #1 ac yna ei allgyrchu ar 2500 rpm am 5 munud i gael gwared ar y myceliwm gweddilliol. Casglwyd yr uwchnofiant a'i storio ar 4°C i bennu ocsalad yn feintiol ymhellach. Ar gyfer paratoi samplau planhigion, echdynnwyd tua 0.1 g o ddarnau meinwe planhigion dair gwaith gyda dŵr distyll (2 ml bob tro). Yna cafodd y samplau eu centrifugio ar 2500 rpm am 5 munud, hidlwyd yr uwchnofant yn sych trwy bapur hidlo Whatman Rhif 1 a'i gasglu i'w ddadansoddi ymhellach.
Ar gyfer dadansoddiad meintiol o asid ocsalig, paratowyd y cymysgedd adwaith mewn tiwb gwydr â stop yn y drefn ganlynol: 0.2 ml o sampl (neu hidlydd diwylliant PDB neu doddiant safonol asid ocsalig), 0.11 ml o las bromoffenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, UDA), 0.198 ml o asid sylffwrig 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Yr Aifft) a 0.176 ml o botasiwm dicromad 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, UDA), ac yna cafodd y toddiant ei wanhau i 4.8 ml gyda dŵr distyll, ei gymysgu'n egnïol a'i roi ar unwaith mewn baddon dŵr 60 °C. Ar ôl 10 munud, ataliwyd yr adwaith trwy ychwanegu 0.5 ml o doddiant sodiwm hydrocsid (NaOH; 0.75 M). Mesurwyd amsugnedd (A600) y cymysgedd adwaith ar 600 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV-160 (Shimadzu Corporation, Japan). Defnyddiwyd PDB a dŵr distyll fel rheolyddion ar gyfer meintioli hidlyddion diwylliant a samplau planhigion, yn y drefn honno. Penderfynwyd crynodiadau asid ocsalig yn yr hidlyddion diwylliant, a fynegir fel microgramau o asid ocsalig fesul mililitr o gyfrwng PDB (μg.mL−1), ac yn y darnau dail, a fynegir fel microgramau o asid ocsalig fesul gram o bwysau ffres (μg.g−1 FW), gan ddefnyddio cromlin calibradu asid ocsalig (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, UDA).
Drwy gydol yr astudiaeth, cynlluniwyd yr holl arbrawf mewn dyluniad cwbl ar hap (CRD) gyda chwe dyblygiad biolegol fesul triniaeth a phum pot fesul dyblygiad biolegol (dau blanhigyn fesul pot) oni nodir yn wahanol. Dadansoddwyd dyblygiadau biolegol yn ddyblyg (dau ddyblygiad technegol). Defnyddiwyd dyblygiadau technegol i wirio atgynhyrchadwyedd yr un arbrawf ond ni chawsant eu defnyddio yn y dadansoddiad ystadegol er mwyn osgoi dyblygiadau ffug. Dadansoddwyd data yn ystadegol gan ddefnyddio dadansoddiad amrywiant (ANOVA) ac yna prawf gwahaniaeth arwyddocâd gonest Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Ar gyfer arbrofion in vitro, cyfrifwyd gwerthoedd IC50 ac IC99 gan ddefnyddio'r model probit a chyfrifwyd cyfyngau hyder 95%.
Casglwyd cyfanswm o bedwar ynysolyn o wahanol gaeau ffa soia yn Nhalaith El Ghabiya, yr Aifft. Ar gyfrwng PDA, cynhyrchodd yr holl ynysolyn myceliwm gwyn hufennog a drodd yn wyn cotwm yn gyflym (Ffigur 1A) ac yna'n llwydfelyn neu'n frown yng nghyfnod y sclerotiwm. Mae sclerotia fel arfer yn drwchus, yn ddu, yn sfferig neu'n afreolaidd o ran siâp, 5.2 i 7.7 mm o hyd a 3.4 i 5.3 mm mewn diamedr (Ffigur 1B). Er bod pedwar ynysolyn wedi datblygu patrwm ymylol o sclerotia ar ymyl y cyfrwng diwylliant ar ôl 10–12 diwrnod o ddeori ar 25 ± 2 °C (Ffig. 1A), roedd nifer y sclerotia fesul plât yn sylweddol wahanol rhyngddynt (P < 0.001), gydag ynysolyn 3 yn cynnwys y nifer uchaf o sclerotia (32.33 ± 1.53 sclerotia fesul plât; Ffig. 1C). Yn yr un modd, cynhyrchodd ynysol #3 fwy o asid ocsalig yn PDB nag ynysolion eraill (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Ffig. 1D). Dangosodd ynysol #3 nodweddion morffolegol a microsgopig nodweddiadol y ffwng ffytopathogenig Sclerotinia sclerotiorum. Er enghraifft, ar PDA, tyfodd cytrefi ynysol #3 yn gyflym, roeddent yn wyn hufennog (Ffigur 1A), yn llwydfelyn gwrthdro neu'n felyn-frown eog golau, ac roedd angen 6-7 diwrnod ar 25 ± 2°C i orchuddio wyneb plât 9 cm mewn diamedr yn llwyr. Yn seiliedig ar y nodweddion morffolegol a microsgopig uchod, nodwyd ynysol #3 fel Sclerotinia sclerotiorum.
Ffigur 1. Nodweddion a pathogenedd ynysyddion S. sclerotiorum o gnydau codlysiau cyffredin. (A) Twf myceliwm pedwar ynysydd S. sclerotiorum ar gyfrwng PDA, (B) sclerotia pedwar ynysydd S. sclerotiorum, (C) nifer y sclerotia (fesul plât), (D) secretiad asid ocsalig ar gyfrwng PDB (μg.mL−1), a (E) difrifoldeb clefyd (%) pedwar ynysydd S. sclerotiorum ar gyltifar codlysiau masnachol agored i niwed Giza 3 o dan amodau tŷ gwydr. Mae gwerthoedd yn cynrychioli'r cymedr ± SD o bum dyblygiad biolegol (n = 5). Mae llythrennau gwahanol yn dynodi gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng triniaethau (p < 0.05). (F–H) Ymddangosodd symptomau llwydni gwyn nodweddiadol ar goesynnau a siliques uwchben y ddaear, yn y drefn honno, 10 diwrnod ar ôl brechu gydag ynysydd #3 (dpi). (I) Perfformiwyd dadansoddiad esblygiadol o ranbarth trawsgrifiedig mewnol (ITS) ynysydd S. sclerotiorum #3 gan ddefnyddio'r dull tebygolrwydd mwyaf a'i gymharu â 20 o ynysyddion/straenau cyfeirio a gafwyd o gronfa ddata'r Ganolfan Genedlaethol ar gyfer Gwybodaeth Biotechnoleg (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Mae'r rhifau uwchben y llinellau clwstwr yn nodi cwmpas y rhanbarth (%), ac mae'r rhifau islaw'r llinellau clwstwr yn nodi hyd y gangen.
Ar ben hynny, i gadarnhau'r pathogenedd, defnyddiwyd pedwar ynysydd S. sclerotiorum a gafwyd i frechu'r cyltifar ffa masnachol agored i niwed Giza 3 o dan amodau tŷ gwydr, sy'n gyson â rhagdybiaethau Koch (Ffig. 1E). Er bod yr holl ynysyddion ffwngaidd a gafwyd yn bathogenig a gallent heintio'r ffa werdd (cv. Giza 3), gan achosi symptomau llwydni gwyn nodweddiadol ar bob rhan uwchben y ddaear (Ffig. 1F), yn enwedig ar y coesynnau (Ffig. 1G) a'r codennau (Ffig. 1H) 10 diwrnod ar ôl y brechiad (dpi), ynysydd 3 oedd yr ynysydd mwyaf ymosodol mewn dau arbrawf annibynnol. Ynysydd 3 oedd â'r difrifoldeb clefyd uchaf (%) ar blanhigion ffa (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, a 76.7 ± 3.1 ar 7, 14, a 21 diwrnod ar ôl yr haint, yn y drefn honno; Ffigur 1F).
Cadarnhawyd ymhellach adnabod yr ynysydd S. sclerotiorum mwyaf ymledol #3 yn seiliedig ar ddilyniannu bylchwr trawsgrifiedig mewnol (ITS) (Ffig. 1I). Dangosodd dadansoddiad ffylogenetig rhwng ynysydd #3 a 20 o ynysyddion/straenau cyfeirio tebygrwydd uchel (>99%) rhyngddynt. Mae'n werth nodi bod gan ynysydd S. sclerotiorum #3 (533 bp) debygrwydd uchel i'r ynysydd S. sclerotiorum Americanaidd LPM36 a ynyswyd o hadau pys sych (rhif mynediad GenBank MK896659.1; 540 bp) ac ynysydd S. sclerotiorum Tsieineaidd YKY211 (rhif mynediad GenBank OR206374.1; 548 bp), sy'n achosi pydredd coesyn fioled (Matthiola incana), y mae pob un ohonynt wedi'u grwpio ar wahân ar frig y dendrogram (Ffigur 1I). Mae'r dilyniant newydd wedi'i adneuo yn gronfa ddata NCBI ac wedi'i enwi'n “Sclerotinia sclerotiorum – ynysu YN-25” (rhif mynediad GenBank PV202792). Gellir gweld mai ynysu 3 yw'r ynysu mwyaf ymledol; felly, dewiswyd yr ynysu hwn i'w astudio ym mhob arbrawf dilynol.
Ymchwiliwyd in vitro i weithgaredd gwrthfacterol y diamin L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, yr Almaen) ar wahanol grynodiadau (12.5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/L) yn erbyn ynysu 3 o S. sclerotiorum. Mae'n werth nodi bod L-ornithine wedi rhoi effaith gwrthfacterol ac wedi atal twf rheiddiol hyffae S. sclerotiorum yn raddol mewn modd sy'n ddibynnol ar y dos (Ffigur 2A, B). Ar y crynodiad uchaf a brofwyd (125 mg/L), dangosodd L-ornithine y gyfradd atal twf myceliwm uchaf (99.62 ± 0.27%; Ffigur 2B), a oedd yn cyfateb i'r ffwngleiddiad masnachol Rizolex-T (cyfradd atal 99.45 ± 0.39%; Ffigur 2C) ar y crynodiad uchaf a brofwyd (10 mg/L), gan nodi effeithiolrwydd tebyg.
Ffigur 2. Gweithgaredd gwrthfacterol in vitro L-ornithine yn erbyn Sclerotinia sclerotiorum. (A) Cymhariaeth o weithgaredd gwrthfacterol gwahanol grynodiadau o L-ornithine yn erbyn S. sclerotiorum gyda'r ffwngleiddiad masnachol Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Cyfradd atal (%) twf myceliwm S. sclerotiorum ar ôl triniaeth gyda gwahanol grynodiadau o L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/L) neu Rizolex-T (2, 4, 6, 8 a 10 mg/L), yn y drefn honno. Mae'r gwerthoedd yn cynrychioli'r cymedr ± SD o bum dyblygiad biolegol (n = 5). Mae llythrennau gwahanol yn dynodi gwahaniaethau ystadegol rhwng triniaethau (p < 0.05). (D, E) Dadansoddiad atchweliad model probit o L-ornithine a'r ffwngleiddiad masnachol Rizolex-T, yn y drefn honno. Dangosir llinell atchweliad y model probit fel llinell las solet, a dangosir y cyfwng hyder (95%) fel llinell goch doredig.
Yn ogystal, perfformiwyd dadansoddiad atchweliad probit a dangosir y plotiau cyfatebol yn Nhabl 1 a Ffigurau 2D,E. Yn gryno, roedd y gwerth llethr derbyniol (y = 2.92x − 4.67) ac ystadegau arwyddocaol cysylltiedig (Cox a Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 a p < 0.0001; Ffigur 2D) o L-ornithine yn dangos gweithgaredd gwrthffyngol gwell yn erbyn S. sclerotiorum o'i gymharu â'r ffwngleiddiad masnachol Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox a Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 a p < 0.0001) (Tabl 1).
Tabl 1. Gwerthoedd crynodiad ataliol hanner uchaf (IC50) ac IC99 (mg/l) o L-ornithine a'r ffwngleiddiad masnachol “Rizolex-T” yn erbyn S. sclerotiorum.
At ei gilydd, gostyngodd L-ornithine (250 mg/L) ddatblygiad a difrifoldeb llwydni gwyn yn sylweddol ar blanhigion ffa cyffredin wedi'u trin o'i gymharu â phlanhigion wedi'u heintio â S. sclerotiorum heb eu trin (rheolaeth; Ffigur 3A). Yn gryno, er bod difrifoldeb y clefyd mewn planhigion rheoli heintiedig heb eu trin wedi cynyddu'n raddol (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, a 92.33 ± 3.06%), gostyngodd L-ornithine ddifrifoldeb y clefyd (%) yn sylweddol drwy gydol yr arbrawf (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, a 26.36 ± 3.07) 7, 14, a 21 diwrnod ar ôl y driniaeth (dpt), yn y drefn honno (Ffigur 3A). Yn yr un modd, pan gafodd planhigion ffa wedi'u heintio â S. sclerotiorum eu trin â 250 mg/L o L-ornithine, gostyngodd yr arwynebedd o dan gromlin dilyniant y clefyd (AUDPC) o 1274.33 ± 33.13 yn y rheolydd heb ei drin i 281.03 ± 7.95, a oedd ychydig yn is na'r arwynebedd ar gyfer y rheolydd positif 50 mg/L o ffwngladdiad Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Ffig. 3B). Gwelwyd yr un duedd yn yr ail arbrawf.
Ffig. 3. Effaith rhoi L-ornithin alldarddol ar ddatblygiad pydredd gwyn ffa cyffredin a achosir gan Sclerotinia sclerotiorum o dan amodau tŷ gwydr. (A) Cromlin dilyniant clefyd llwydni gwyn ffa cyffredin ar ôl triniaeth gyda 250 mg/L o L-ornithin. (B) Arwynebedd o dan gromlin dilyniant clefyd (AUDPC) llwydni gwyn ffa cyffredin ar ôl triniaeth gydag L-ornithin. Mae gwerthoedd yn cynrychioli'r cymedr ± SD o bum dyblygiad biolegol (n = 5). Mae llythrennau gwahanol yn dynodi gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng triniaethau (p < 0.05).
Cynyddodd rhoi 250 mg/L o L-ornithine yn raddol uchder y planhigyn (Ffig. 4A), nifer y canghennau fesul planhigyn (Ffig. 4B), a nifer y dail fesul planhigyn (Ffig. 4C) ar ôl 42 diwrnod. Er bod gan y ffwngladdiad masnachol Rizolex-T (50 mg/L) yr effaith fwyaf ar yr holl baramedrau maethol a astudiwyd, rhoi 250 mg/L o L-ornithine yn yr alltud oedd â'r ail effaith fwyaf o'i gymharu â rheolyddion heb eu trin (Ffigau 4A–C). Ar y llaw arall, ni chafodd triniaeth L-ornithine unrhyw effaith sylweddol ar gynnwys pigmentau ffotosynthetig cloroffyl a (Ffig. 4D) a chloroffyl b (Ffig. 4E), ond cynyddodd ychydig gyfanswm y cynnwys carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) o'i gymharu â'r rheolaeth negyddol (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) a'r rheolaeth bositif (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Ffig. 4F). At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos nad yw L-ornithine yn ffytowensig i godlysiau wedi'u trin a gall hyd yn oed ysgogi eu twf.
Ffig. 4. Effaith rhoi L-ornithin alldarddol ar nodweddion twf a pigmentau ffotosynthetig dail ffa sydd wedi'u heintio â Sclerotinia sclerotiorum o dan amodau tŷ gwydr. (A) Uchder y planhigyn (cm), (B) Nifer y canghennau fesul planhigyn, (C) Nifer y dail fesul planhigyn, (D) Cynnwys cloroffyl a (mg g-1 fr wt), (E) Cynnwys cloroffyl b (mg g-1 fr wt), (F) Cyfanswm cynnwys carotenoid (mg g-1 fr wt). Gwerthoedd yw'r cymedr ± SD o bum dyblygiad biolegol (n = 5). Mae llythrennau gwahanol yn dynodi gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng triniaethau (p < 0.05).
Datgelodd lleoleiddio histochemegol in situ rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS; wedi'u mynegi fel hydrogen perocsid [H2O2]) a radicalau rhydd (a fynegir fel anionau superocsid [O2•−]) fod rhoi L-ornithin (250 mg/L) yn alldarddol wedi lleihau croniad H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Ffig. 5A) ac O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Ffig. 5B) yn sylweddol o'i gymharu â chroniad planhigion heintiedig heb eu trin (173.31 ± 12.06 a 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, yn y drefn honno) a phlanhigion a gafodd eu trin â 50 mg/L o'r ffwngladdiad masnachol Rizolex-T (170.12 ± 9.50 a 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, yn y drefn honno) ar ôl 72 awr. Cronnodd lefelau uchel o H2O2 ac O2•− o dan hpt (Ffig. 5A, B). Yn yr un modd, dangosodd assay malondialdehyde (MDA) seiliedig ar TCA fod planhigion ffa wedi'u heintio â S. sclerotiorum wedi cronni lefelau uwch o MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) yn eu dail (Ffig. 5C). Fodd bynnag, lleihaodd rhoi L-ornithine alldarddol berocsidiad lipid yn sylweddol fel y dangosir gan y gostyngiad yng nghynnwys MDA mewn planhigion a gafodd eu trin (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Ffig. 5. Effaith rhoi L-ornithin alldarddol ar brif farcwyr straen ocsideiddiol a mecanweithiau amddiffyn gwrthocsidydd an-ensymatig mewn dail ffa wedi'u heintio â S. sclerotiorum 72 awr ar ôl yr haint o dan amodau tŷ gwydr. (A) Hydrogen perocsid (H2O2; nmol g−1 FW) ar 72 hpt, (B) anion uwchocsid (O2•−; nmol g−1 FW) ar 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) ar 72 hpt, (D) cyfanswm ffenolau hydawdd (mg GAE g−1 FW) ar 72 hpt, (E) cyfanswm flavonoidau hydawdd (mg RE g−1 FW) ar 72 hpt, (F) cyfanswm asidau amino rhydd (mg g−1 FW) ar 72 hpt, a (G) cynnwys prolin (mg g−1 FW) ar 72 hpt. Mae'r gwerthoedd yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol (cymedr ± SD) o 5 dyblygiad biolegol (n = 5). Mae llythrennau gwahanol yn dynodi gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng triniaethau (p < 0.05).