Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae nanoronynnau inswlin (NPs) â chynnwys llwyth uchel wedi dod o hyd i wahanol gymwysiadau mewn gwahanol ffurfiau dos. Nod y gwaith hwn yw gwerthuso effaith prosesau sychu-rhewi a sychu-chwistrellu ar strwythur nanoronynnau chitosan wedi'u llwytho ag inswlin, gyda neu heb mannitol fel cryo-amddiffynnydd. Fe wnaethom hefyd asesu ansawdd y nanoronynnau hyn trwy eu hail-ddiddymu. Cyn dadhydradu, optimeiddiwyd maint gronynnau'r nanoronynnau croesgysylltiedig chitosan/sodiwm tripolyfosffad/inswlin i fod yn 318 nm, roedd y PDI yn 0.18, roedd effeithlonrwydd capsiwleiddio yn 99.4%, a'r llwyth yn 25.01%. Ar ôl ailgyfansoddi, cynhaliodd yr holl nanoronynnau, ac eithrio'r rhai a gynhyrchwyd trwy ddull sychu-rhewi heb ddefnyddio mannitol, eu strwythur gronynnau sfferig. O'i gymharu â nanoronynnau sy'n cynnwys mannitol wedi'u dadhydradu trwy naill ai chwistrellu, dangosodd nanoronynnau sychu-chwistrellu di-mannitol hefyd y maint gronynnau cymedrig lleiaf (376 nm) a'r cynnwys llwytho uchaf. (25.02%) gyda chyfradd amgáu debyg (98.7%) a PDI (0.20) trwy dechnegau sychu neu rewi-sychu. Arweiniodd y nanoronynnau sych trwy sychu chwistrell heb mannitol hefyd at y rhyddhau inswlin cyflymaf a'r effeithlonrwydd uchaf o ran amsugno cellog. Mae'r gwaith hwn yn dangos y gall sychu chwistrell ddadhydradu nanoronynnau inswlin heb yr angen am gryo-amddiffynyddion o'i gymharu â dulliau rhewi-sychu confensiynol, gan greu capasiti llwytho mwy, gofynion ychwanegion is a chostau gweithredu mantais sylweddol.
Ers ei ddarganfod ym 19221,2,3, mae inswlin a'i baratoadau fferyllol wedi achub bywydau cleifion â diabetes math 1 (T1DM) a diabetes math 2 (T1DM). Fodd bynnag, oherwydd ei briodweddau fel protein pwysau moleciwlaidd uchel, mae inswlin yn hawdd ei agregu, ei ddadelfennu gan ensymau proteolytig, a'i ddileu gan yr effaith pasio cyntaf. Mae angen pigiadau inswlin ar bobl sy'n cael diagnosis o ddiabetes math 1 am weddill eu hoes. Mae angen pigiadau inswlin hirdymor ar lawer o gleifion sy'n cael diagnosis o ddiabetes math 2 i ddechrau hefyd. Mae pigiadau inswlin dyddiol yn ffynhonnell ddifrifol o boen ac anghysur dyddiol i'r unigolion hyn, gydag effeithiau negyddol ar iechyd meddwl. O ganlyniad, mae mathau eraill o weinyddu inswlin sy'n achosi llai o anghysur, fel gweinyddu inswlin trwy'r geg, yn cael eu hastudio'n helaeth5 gan fod ganddynt y potensial i adfer ansawdd bywyd tua 5 biliwn o bobl â diabetes ledled y byd.
Mae technoleg nanoronynnau wedi darparu datblygiad sylweddol mewn ymdrechion i gymryd inswlin llafar4,6,7. Un sy'n amgáu ac yn amddiffyn inswlin yn effeithiol rhag diraddio ar gyfer ei gyflenwi wedi'i dargedu i safleoedd penodol ar y corff.Fodd bynnag, mae gan ddefnyddio fformwleiddiadau nanoronynnau sawl cyfyngiad, yn bennaf oherwydd problemau sefydlogrwydd ataliadau gronynnau.Gall rhywfaint o agregu ddigwydd yn ystod storio, sy'n lleihau bioargaeledd nanoronynnau sy'n llawn inswlin8.Yn ogystal, rhaid ystyried sefydlogrwydd cemegol matrics polymer nanoronynnau ac inswlin hefyd i sicrhau sefydlogrwydd nanoronynnau inswlin (NPs).Ar hyn o bryd, technoleg sychu-rewi yw'r safon aur ar gyfer creu NPs sefydlog wrth atal newidiadau diangen yn ystod storio9.
Fodd bynnag, mae sychu-rewi yn gofyn am ychwanegu cryo-amddiffynyddion i atal strwythur sfferig NPs rhag cael ei effeithio gan straen mecanyddol crisialau iâ. Mae hyn yn lleihau llwyth nanoronynnau inswlin yn sylweddol ar ôl lyoffilio, gan fod y cryo-amddiffynydd yn meddiannu'r rhan fwyaf o'r gymhareb pwysau. Felly, yn aml canfyddir nad yw'r NPs inswlin a gynhyrchir yn addas ar gyfer cynhyrchu fformwleiddiadau powdr sych, fel tabledi geneuol a ffilmiau geneuol, oherwydd yr angen am symiau mawr o nanoronynnau sych i gyflawni ffenestr therapiwtig inswlin.
Mae sychu chwistrellu yn broses ddiwydiannol adnabyddus a rhad ar gyfer cynhyrchu powdrau sych o gyfnodau hylif yn y diwydiant fferyllol10,11. Mae rheolaeth dros y broses ffurfio gronynnau yn caniatáu amgáu nifer o gyfansoddion bioactif yn briodol12, 13. Ar ben hynny, mae wedi dod yn dechneg effeithiol ar gyfer paratoi proteinau wedi'u capsiwleiddio i'w rhoi drwy'r geg.Yn ystod sychu chwistrellu, mae dŵr yn anweddu'n gyflym iawn, sy'n helpu i gadw tymheredd craidd y gronynnau'n isel11,14, gan alluogi ei gymhwyso i amgáu cydrannau sy'n sensitif i wres.Cyn sychu chwistrellu, dylid homogeneiddio'r deunydd cotio yn drylwyr gyda'r toddiant sy'n cynnwys y cynhwysion wedi'u capsiwleiddio11,14.Yn wahanol i sychu rhewi, mae homogeneiddio cyn amgáu mewn sychu chwistrellu yn gwella effeithlonrwydd amgáu yn ystod dadhydradiad.Gan nad oes angen cryo-amddiffynyddion ar y broses amgáu sychu chwistrellu, gellir defnyddio sychu chwistrellu i gynhyrchu NPs sych gyda chynnwys llwytho uchel.
Mae'r astudiaeth hon yn adrodd ar gynhyrchu nanoparticles llwythog inswlin trwy groesgysylltu chitosan a sodiwm tripolyfosffad gan ddefnyddio dull gel ïon. Mae gelation ïon yn ddull paratoi sy'n caniatáu cynhyrchu nanoronynnau trwy ryngweithiadau electrostatig rhwng dau neu fwy o rywogaethau ïonig o dan rai amodau. Defnyddiwyd technegau rhewi-sychu a sychu chwistrellu i ddadhydradu'r nanoronynnau croesgysylltiedig chitosan/sodiwm tripolyfosffad/inswlin wedi'u optimeiddio. Ar ôl dadhydradu, dadansoddwyd eu morffoleg gan SEM. Gwerthuswyd eu gallu ailgyfuno trwy fesur eu dosbarthiad maint, gwefr arwyneb, PDI, effeithlonrwydd capsiwleiddio, a chynnwys llwytho. Gwerthuswyd ansawdd y nanoronynnau wedi'u hail-hydoddi a gynhyrchwyd gan wahanol ddulliau dadhydradu hefyd trwy gymharu eu hamddiffyniad inswlin, ymddygiad rhyddhau, ac effeithiolrwydd amsugno cellog.
Mae pH y toddiant cymysg a'r gymhareb o chitosan ac inswlin yn ddau ffactor allweddol sy'n effeithio ar faint gronynnau ac effeithlonrwydd capsiwleiddio (EE) y nano-ronynnau terfynol, gan eu bod yn effeithio'n uniongyrchol ar y broses geleiddio ïonotropig. Dangoswyd bod pH y toddiant cymysg yn gysylltiedig iawn â maint gronynnau ac effeithlonrwydd capsiwleiddio (Ffig. 1a). Fel y dangosir yn Ffig. 1a, wrth i'r pH gynyddu o 4.0 i 6.0, gostyngodd maint cyfartalog y gronynnau (nm) a chynyddodd yr EE yn sylweddol, tra pan gynyddodd y pH i 6.5, dechreuodd maint cyfartalog y gronynnau gynyddu ac arhosodd yr EE yr un fath. Wrth i'r gymhareb o chitosan i inswlin gynyddu, mae maint cyfartalog y gronynnau hefyd yn cynyddu. Ar ben hynny, ni welwyd unrhyw newid yn yr EE pan baratowyd nanoronynnau ar gymhareb màs o chitosan/inswlin yn uwch na 2.5:1 (w/w) (Ffig. 1b). Felly, defnyddiwyd yr amodau paratoi gorau posibl yn yr astudiaeth hon (pH 6.0, cymhareb màs chitosan/inswlin o 2.5:1). i baratoi nanoronynnau wedi'u llwytho ag inswlin ar gyfer astudiaeth bellach. O dan yr amod paratoi hwn, optimeiddiwyd maint gronynnau cyfartalog nanoronynnau inswlin i fod yn 318 nm (Ffig. 1c), roedd y PDI yn 0.18, roedd yr effeithlonrwydd mewnosod yn 99.4%, roedd y potensial zeta yn 9.8 mv, ac roedd y llwyth inswlin yn 25.01% (m/m). Yn seiliedig ar ganlyniadau microsgopeg electron trosglwyddo (TEM), roedd y nanoronynnau wedi'u optimeiddio yn fras sfferig ac arwahanol gyda maint cymharol unffurf (Ffig. 1d).
Optimeiddio paramedrau nanoronynnau inswlin: (a) effaith pH ar y diamedr cymedrig ac effeithlonrwydd amgáu (EE) nanoronynnau inswlin (wedi'u paratoi ar gymhareb màs o 5:1 o chitosan ac inswlin); (b) chitosan a dylanwad cymhareb màs inswlin ar y diamedr cymedrig ac effeithlonrwydd amgáu (EE) nanoronynnau inswlin (wedi'u paratoi ar pH 6); (c) dosbarthiad maint gronynnau nanoronynnau inswlin wedi'u optimeiddio; (d) micrograff TEM o nanoronynnau inswlin wedi'u optimeiddio.
Mae'n hysbys bod chitosan yn polyelectrolyt gwan gyda pKa o 6.5. Mae wedi'i wefru'n bositif mewn cyfryngau asidig oherwydd bod ei brif grŵp amino wedi'i brotoneiddio gan ïonau hydrogen15. Felly, fe'i defnyddir yn aml fel cludwr i gapsiwleiddio macromoleciwlau â gwefr negyddol. Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd chitosan i gapsiwleiddio inswlin gyda phwynt isoelectrig o 5.3. Gan fod chitosan yn cael ei ddefnyddio fel deunydd cotio, gyda chynnydd ei gyfran, mae trwch haen allanol y nanoronynnau yn cynyddu'n gyfatebol, gan arwain at faint gronynnau cyfartalog mwy. Yn ogystal, gall lefelau uwch o chitosan gapsiwleiddio mwy o inswlin. Yn ein hachos ni, roedd EE ar ei uchaf pan gyrhaeddodd cymhareb chitosan ac inswlin 2.5:1, ac nid oedd unrhyw newid sylweddol yn EE pan barhaodd y gymhareb i gynyddu.
Heblaw am y gymhareb o chitosan ac inswlin, chwaraeodd pH rôl hanfodol hefyd wrth baratoi nanoronynnau nano. Astudiodd Gan et al. 17 effaith pH ar faint gronynnau nanoronynnau chitosan. Fe wnaethant ganfod gostyngiad parhaus ym maint y gronynnau nes i'r pH gyrraedd 6.0, a gwelwyd cynnydd sylweddol ym maint y gronynnau ar pH > 6.0, sy'n gyson â'n harsylwadau ni. Mae'r ffenomen hon oherwydd y ffaith, wrth i'r pH gynyddu, bod y moleciwl inswlin yn caffael gwefr arwyneb negyddol, gan ffafrio rhyngweithiadau electrostatig gyda'r cymhlyg chitosan/sodiwm tripolyfosffad (TPP), gan arwain at faint gronynnau bach ac EE uchel. Fodd bynnag, pan addaswyd y pH i 6.5, cafodd y grwpiau amino ar chitosan eu dad-brotoneiddio, gan arwain at blygiad chitosan. Felly, mae pH uchel yn arwain at lai o amlygiad ïonau amino i TPP ac inswlin, gan arwain at groesgysylltu is, maint gronynnau cyfartalog terfynol mwy ac EE is.
Gall dadansoddi priodweddau morffolegol nanoparthau sych-rewi a sych-chwistrellu arwain at ddewis technegau dadhydradu a ffurfio powdr gwell. Dylai'r dull dewisol ddarparu sefydlogrwydd cyffuriau, siâp gronynnau unffurf, llwyth cyffuriau uchel a hydoddedd da yn yr hydoddiant gwreiddiol. Yn yr astudiaeth hon, er mwyn cymharu'r ddau dechneg yn well, defnyddiwyd nanoparthau inswlin gyda neu heb 1% mannitol yn ystod dadhydradu. Defnyddir mannitol fel asiant swmpio neu gryo-amddiffynnydd mewn amrywiol fformwleiddiadau powdr sych ar gyfer sychu-rewi a sychu-chwistrellu. Ar gyfer y nanoparthau inswlin wedi'u lyoffilio heb mannitol, fel y dangosir yn Ffigur 2a, gwelwyd strwythur powdr mandyllog iawn gydag arwynebau mawr, afreolaidd a garw o dan ficrosgopeg electron sganio (SEM). Canfuwyd ychydig o ronynnau arwahanol yn y powdr ar ôl dadhydradu (Ffig. 2e). Dangosodd y canlyniadau hyn fod y rhan fwyaf o'r nanoparthau wedi'u dadelfennu yn ystod sychu-rewi heb unrhyw gryo-amddiffynnydd. Ar gyfer nanoparthau inswlin sych-rewi a sych-chwistrellu sy'n cynnwys 1% mannitol, gwelwyd nanoparthau sfferig gydag arwynebau llyfn (Ffig. 2b,d,f,h). Inswlin Arhosodd nanoronynnau a sychwyd â chwistrell heb mannitol yn sfferig ond yn grychlyd ar yr wyneb (Ffig. 2c). Trafodir arwynebau sfferig a chrychlyd ymhellach yn y profion ymddygiad rhyddhau ac amsugno cellog isod. Yn seiliedig ar ymddangosiad gweladwy'r nanoronynnau sych, cynhyrchodd nanoronynnau a sychwyd â chwistrell heb mannitol a nanoronynnau a sychwyd â rhew-sych a chwistrell-sych gyda mannitol bowdrau NP mân (Ffig. 2f,g,h). Po fwyaf yw'r arwynebedd rhwng arwynebau'r gronynnau, yr uchaf yw'r hydoddedd ac felly'r uchaf yw'r gyfradd rhyddhau.
Morffoleg gwahanol NPs inswlin dadhydradedig: (a) Delwedd SEM o NPs inswlin wedi'u lyoffilio heb mannitol; (b) Delwedd SEM o NPs inswlin wedi'u lyoffilio gyda mannitol; (c) NPs inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu heb mannitol Delwedd SEM o ; (d) Delwedd SEM o NPs inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu gyda mannitol; (e) delwedd o bowdr NPs inswlin wedi'u lyoffilio heb mannitol; (f) delwedd o NPs inswlin wedi'u lyoffilio gyda mannitol; (g) Delwedd o bowdr NPs inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu heb mannitol; (h) delwedd o bowdr NPs inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu gyda mannitol.
Yn ystod sychu-rewi, mae mannitol yn gweithredu fel cryo-amddiffynnydd, gan gadw NPs mewn ffurf amorffaidd ac atal difrod gan grisialau iâ19. Mewn cyferbyniad, nid oes cam rhewi yn ystod sychu chwistrell. Felly nid oes angen mannitol yn y dull hwn. Mewn gwirionedd, cynhyrchodd NPs wedi'u sychu-chwistrellu heb mannitol NPs mwy mân fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Fodd bynnag, gall mannitol barhau i weithredu fel llenwr yn y broses sychu-chwistrellu i roi strwythur mwy sfferig i NPs20 (Ffig. 2d), sy'n helpu i gael ymddygiad rhyddhau unffurf NPs wedi'u capsiwleiddio o'r fath. Yn ogystal, mae'n amlwg y gellir canfod rhai gronynnau mawr mewn NPs inswlin wedi'u rhewi-sychu a'u sychu-chwistrellu sy'n cynnwys mannitol (Ffig. 2b,d), a all fod oherwydd cronni mannitol yng nghraidd y gronynnau ynghyd â'r inswlin wedi'i gapsiwleiddio. I.Haen chitosan.Mae'n werth nodi, yn yr astudiaeth hon, er mwyn sicrhau bod y strwythur sfferig yn aros yn gyfan ar ôl dadhydradu, bod y gymhareb o mannitol a chitosan yn cael ei chadw ar 5:1, fel y gall llawer iawn o lenwad hefyd ehangu maint gronynnau'r NPs sych..
Nodweddodd sbectrosgopeg adlewyrchiad cyfan gwanedig isgoch trawsnewid Fourier (FTIR-ATR) y cymysgedd ffisegol o inswlin rhydd, chitosan, chitosan, TPP ac inswlin. Nodweddwyd pob NP dadhydradedig gan ddefnyddio sbectrosgopeg FTIR-ATR. Yn nodedig, gwelwyd dwysterau band o 1641, 1543 a 1412 cm-1 mewn NPs wedi'u capswleiddio a sychwyd â rhewi gyda manitol ac mewn NPs a sychwyd â chwistrell gyda a heb manitol (Ffig. 3). Fel yr adroddwyd yn flaenorol, roedd y cynnydd hwn mewn cryfder yn gysylltiedig â chroesgysylltu rhwng chitosan, TPP ac inswlin. Dangosodd ymchwiliad i'r rhyngweithio rhwng chitosan ac inswlin, yn y sbectrwm FTIR o nanoronynnau chitosan wedi'u llwytho ag inswlin, fod y band chitosan yn gorgyffwrdd â band inswlin, gan gynyddu dwyster y gwregys carbonyl (1641 cm-1) a'r gwregys amin (1543 cm-1). Mae grwpiau tripolyfosffad TPP wedi'u cysylltu â grwpiau amoniwm mewn chitosan, gan ffurfio band yn 1412 cm-1.
Sbectrwm FTIR-ATR o inswlin rhydd, chitosan, cymysgeddau ffisegol o chitosan/TPP/inswlin a NPs wedi'u dadhydradu gan wahanol ddulliau.
Ar ben hynny, mae'r canlyniadau hyn yn gyson â'r rhai a ddangosir yn SEM, a ddangosodd fod y NPs wedi'u capsiwleiddio wedi aros yn gyfan wrth eu chwistrellu a'u rhewi-sychu â mannitol, ond yn absenoldeb mannitol, dim ond sychu chwistrellu a gynhyrchodd ronynnau wedi'u capsiwleiddio. Mewn cyferbyniad, roedd canlyniadau sbectrol FTIR-ATR NPs wedi'u rhewi-sychu heb mannitol yn debyg iawn i'r cymysgedd ffisegol o chitosan, TPP, ac inswlin. Mae'r canlyniad hwn yn dangos nad yw'r croesgysylltiadau rhwng chitosan, TPP ac inswlin yn bresennol mwyach mewn NPs wedi'u rhewi-sychu heb mannitol. Dinistriwyd strwythur yr NPs yn ystod sychu rhewi heb cryo-amddiffynnydd, y gellir ei weld yng nghanlyniadau'r SEM (Ffig. 2a). Yn seiliedig ar forffoleg a chanlyniadau FTIR NPs inswlin dadhydradedig, dim ond NPs wedi'u lyoffilio, wedi'u sychu trwy chwistrellu, a heb mannitol a ddefnyddiwyd ar gyfer arbrofion ailgyfansoddi ac NPs heb mannitol oherwydd dadelfennu NPs heb mannitol yn ystod dadhydradiad. trafodwch.
Defnyddir dadhydradu ar gyfer storio tymor hir ac ailbrosesu i fformwleiddiadau eraill. Mae gallu nanoparthau sych i ailgyfansoddi ar ôl storio yn hanfodol ar gyfer eu defnydd mewn gwahanol fformwleiddiadau fel tabledi a ffilmiau. Sylwon ni mai dim ond ychydig bach y cynyddodd maint gronynnau cyfartalog y nanoparthau inswlin wedi'u sychu â chwistrell yn absenoldeb manitol ar ôl eu hailgyfansoddi. Ar y llaw arall, cynyddodd maint gronynnau'r nanoparthau inswlin wedi'u sychu â chwistrell a'u rhewi-sychu gyda manitol yn sylweddol (Tabl 1). Ni newidiwyd PDI ac EE yn sylweddol (p > 0.05) ar ôl ailgyfuno'r holl nanoparthau yn yr astudiaeth hon (Tabl 1). Mae'r canlyniad hwn yn dangos bod y rhan fwyaf o'r gronynnau wedi aros yn gyfan ar ôl ail-doddi. Fodd bynnag, arweiniodd ychwanegu manitol at ostyngiad mawr mewn llwyth inswlin o nanoparthau manitol wedi'u lyoffilio a'u sychu â chwistrell (Tabl 1). Mewn cyferbyniad, arhosodd cynnwys llwyth inswlin nanoparthau wedi'u sychu â chwistrell heb manitol yr un fath ag o'r blaen (Tabl 1).
Mae'n hysbys bod llwytho nanoronynnau yn hanfodol pan gânt eu defnyddio at ddibenion cyflwyno cyffuriau. Ar gyfer NPs â llwythi isel, mae angen symiau mawr iawn o ddeunydd i gyrraedd y trothwy therapiwtig. Fodd bynnag, mae gludedd uchel crynodiadau NP mor uchel yn arwain at anghyfleustra ac anhawster wrth roi trwy'r geg a fformwleiddiadau chwistrelladwy, yn y drefn honno 22 . Yn ogystal, gellir defnyddio NPs inswlin hefyd i wneud tabledi a bioffilmiau gludiog 23 , 24 , sy'n gofyn am ddefnyddio symiau mawr o NPs ar lefelau llwyth isel, gan arwain at dabledi mawr a bioffilmiau trwchus nad ydynt yn addas ar gyfer cymwysiadau llafar. Felly, mae NPs dadhydradedig â llwyth inswlin uchel yn ddymunol iawn. Mae ein canlyniadau'n awgrymu y gall llwyth inswlin uchel NPs sych-chwistrellu di-mannitol gynnig llawer o fanteision deniadol ar gyfer y dulliau cyflwyno amgen hyn.
Cadwyd yr holl nano-ronynnau dadhydradedig yn yr oergell am dri mis. Dangosodd canlyniadau SEM nad oedd morffoleg yr holl nano-ronynnau dadhydradedig wedi newid yn sylweddol yn ystod y storio tri mis (Ffig. 4). Ar ôl eu hailgyfansoddi mewn dŵr, dangosodd yr holl nano-ronynnau ostyngiad bach yn yr EE a rhyddhawyd tua swm bach (~5%) o inswlin yn ystod y cyfnod storio tri mis (Tabl 2). Fodd bynnag, cynyddodd maint gronynnau cyfartalog yr holl nanoronynnau. Cynyddodd maint gronynnau nano-ronynnau a sychwyd â chwistrell heb mannitol i 525 nm, tra cynyddodd maint gronynnau nano-ronynnau a sychwyd â chwistrell a sychwyd â rhew gyda mannitol i 872 a 921 nm, yn y drefn honno (Tabl 2).
Morffoleg gwahanol nanoparthau inswlin dadhydradedig a storiwyd am dri mis: (a) Delwedd SEM o nanoparthau inswlin wedi'u lyoffilio gyda manitol; (b) Delwedd SEM o nanoronynnau inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu heb manitol; (c) heb fanitol delweddau SEM o nanoparthau inswlin wedi'u sychu trwy chwistrellu.
Ar ben hynny, gwelwyd gwaddodion yn y nanoronynnau inswlin wedi'u hailgyfansoddi a sychwyd â chwistrell â manitol a'u rhewi-sychu (Ffig. S2). Gall hyn gael ei achosi gan ronynnau mawr nad ydynt yn atal yn iawn yn y dŵr. Mae'r holl ganlyniadau uchod yn dangos y gall y dechneg sychu chwistrell amddiffyn nanoronynnau inswlin rhag dadhydradu a bod modd cael llwythi uchel o nanoronynnau inswlin heb unrhyw lenwwyr na chryo-amddiffynwyr.
Profwyd cadw inswlin mewn cyfrwng pH = 2.5 gyda pepsin, trypsin, ac α-chymotrypsin i ddangos gallu amddiffynnol NPs yn erbyn treuliad ensymatig ar ôl dadhydradu. Cymharwyd cadw inswlin NPs dadhydradedig â chadw inswlin NPs newydd eu paratoi, a defnyddiwyd inswlin rhydd fel rheolaeth negyddol. Yn yr astudiaeth hon, dangosodd inswlin rhydd ddileu inswlin cyflym o fewn 4 awr ym mhob un o'r tri thriniaeth ensymatig (Ffig. 5a–c). Mewn cyferbyniad, dangosodd profion dileu inswlin NPs wedi'u rhewi-sychu â manitol a NPs wedi'u sychu â chwistrell gyda neu heb manitol amddiffyniad sylweddol uwch i'r NPs hyn yn erbyn treuliad ensymatig, a oedd yn debyg i amddiffyniad NPs inswlin newydd eu paratoi (ffigur 1).5a-c). Gyda chymorth nanoronynnau mewn pepsin, trypsin, ac α-chymotrypsin, gellid amddiffyn mwy na 50%, 60%, a 75% o inswlin o fewn 4 awr, yn y drefn honno (Ffig. 5a–c). Gall y gallu amddiffynnol inswlin hwn gynyddu'r siawns o amsugno inswlin uwch. i'r llif gwaed25. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall sychu chwistrellu gyda neu heb mannitol a sychu-rewi gyda mannitol gadw gallu amddiffynnol inswlin NPs ar ôl dadhydradu.
Ymddygiad amddiffyn a rhyddhau NPs inswlin dadhydradedig: (a) amddiffyn inswlin mewn toddiant pepsin; (b) amddiffyn inswlin mewn toddiant trypsin; (c) amddiffyn inswlin gan doddiant α-chymotrypsin; (d) Ymddygiad rhyddhau NPs dadhydradedig mewn toddiant pH = 2.5; (e) ymddygiad rhyddhau NPs dadhydradedig mewn toddiant pH = 6.6; (f) ymddygiad rhyddhau NPs dadhydradedig mewn toddiant pH = 7.0.
Cafodd nanoparthau inswlin sych wedi'u paratoi a'u hailgyfansoddi'n ffres eu magu mewn amrywiol byfferau (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ar 37 °C, gan efelychu amgylchedd pH y stumog, y dwodenwm, a'r coluddyn bach uchaf, i archwilio effaith inswlin ar wrthwynebiad inswlin. Ymddygiad rhyddhau mewn gwahanol amgylcheddau. Darn o'r llwybr gastroberfeddol. Ar pH = 2.5, dangosodd NPs wedi'u llwytho ag inswlin a NPs inswlin sych wedi'u hail-hydoddi ryddhad byrstio cychwynnol o fewn yr awr gyntaf, ac yna rhyddhau araf dros y 5 awr nesaf (Ffig. 5d). Mae'n fwyaf tebygol bod y rhyddhau cyflym hwn ar y dechrau yn ganlyniad dad-amsugno arwyneb cyflym moleciwlau protein nad ydynt wedi'u sefydlogi'n llawn yn strwythur mewnol y gronyn. Ar pH = 6.5, dangosodd NPs wedi'u llwytho ag inswlin a NPs inswlin sych wedi'u hailgyfansoddi ryddhad llyfn ac araf dros 6 awr, gan fod pH y toddiant prawf yn debyg i pH y toddiant a baratowyd â NPs (Ffig. 5e). Ar pH = 7, roedd y NPs yn ansefydlog a bron wedi dadelfennu'n llwyr o fewn y ddwy awr gyntaf (Ffig. 5f). Mae hyn oherwydd bod dad-brotoneiddio chitosan yn digwydd ar pH uwch, sy'n arwain at rwydwaith polymer llai cryno a rhyddhau inswlin wedi'i lwytho.
Ar ben hynny, dangosodd y nanoparthau inswlin a sychwyd â chwistrell heb fannitol broffil rhyddhau cyflymach na'r nanoparthau dadhydradedig eraill (Ffig. 5d–f). Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, y nanoparthau inswlin wedi'u hailgyfansoddi a sychwyd heb fannitol a ddangosodd y maint gronynnau lleiaf. Mae gronynnau bach yn darparu arwynebedd mwy, felly bydd y rhan fwyaf o'r cyffur perthnasol ar neu ger wyneb y gronynnau, gan arwain at ryddhau cyffuriau'n gyflym26.
Ymchwiliwyd i wenwyndra NPs gan ddefnyddio assay MTT. Fel y dangosir yn Ffigur S4, canfuwyd nad oedd gan yr holl NPs dadhydradedig unrhyw effaith sylweddol ar hyfywedd celloedd ar grynodiadau o 50–500 μg/ml, sy'n awgrymu y gellir defnyddio'r holl NPs dadhydradedig yn ddiogel i gyrraedd y ffenestr therapiwtig.
Yr afu yw'r prif organ y mae inswlin yn arfer ei swyddogaethau ffisiolegol drwyddo. Mae celloedd HepG2 yn llinell gelloedd hepatoma dynol a ddefnyddir yn gyffredin fel model cymeriant hepatocyte in vitro. Yma, defnyddiwyd celloedd HepG2 i asesu cymeriant cellog NPs dadhydradedig gan ddefnyddio dulliau sychu-rewi a sychu-chwistrellu. Cymeriant cellog trwy sganio laser confocal gan ddefnyddio cytometry llif a gweledigaeth yn dilyn sawl awr o ddeori gydag inswlin FITC rhydd ar grynodiad o 25 μg/mL, NPs llwythog inswlin FITC wedi'u paratoi'n ffres a NPs llwythog inswlin FITC dadhydradedig ar grynodiadau inswlin cyfartal. Perfformiwyd arsylwadau microsgopeg meintiol (CLSM). Dinistriwyd NPs lyoffilig heb mannitol yn ystod dadhydradiad ac ni chawsant eu gwerthuso yn y prawf hwn. Roedd dwysterau fflwroleuedd mewngellol NPs llwythog inswlin wedi'u paratoi'n ffres, NPs lyoffilig gyda mannitol, a NPs sychu-chwistrellu gyda a heb mannitol (Ffig. 6a) 4.3, 2.6, 2.4, a 4.1 gwaith yn uwch na'r rhai rhydd. Inswlin FITC grŵp, yn y drefn honno (Ffig. 6b). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod inswlin wedi'i gapsiwleiddio yn fwy grymus o ran amsugno cellog nag inswlin rhydd, yn bennaf oherwydd maint llai y nanoronynnau sy'n llawn inswlin a gynhyrchwyd yn yr astudiaeth.
Cymeriant celloedd HepG2 ar ôl 4 awr o ddeori gyda NPs ffres wedi'u paratoi a NPs dadhydradedig: (a) Dosbarthiad cymeriant inswlin FITC gan gelloedd HepG2. (b) Cymedr geometrig dwysterau fflwroleuol a ddadansoddwyd gan cytometry llif (n = 3), *P < 0.05 o'i gymharu ag inswlin rhydd.
Yn yr un modd, dangosodd y delweddau CLSM fod dwysterau fflwroleuedd FITC NPs wedi'u llwytho ag inswlin FITC wedi'u paratoi'n ffres a NPs wedi'u sychu trwy chwistrell wedi'u llwytho ag inswlin FITC (heb mannitol) yn llawer cryfach na dwysterau'r samplau eraill (Ffig. 6a). Ar ben hynny, gydag ychwanegu mannitol, cynyddodd gludedd uwch yr hydoddiant y gwrthiant i amsugno cellog, gan arwain at ostyngiad yn amlhau inswlin. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod NPs wedi'u sychu trwy chwistrell heb fanitol wedi arddangos yr effeithlonrwydd amsugno cellog uchaf oherwydd bod maint eu gronynnau yn llai na maint NPs wedi'u sychu-rewi ar ôl eu hail-doddi.
Prynwyd chitosan (pwysau moleciwlaidd cyfartalog 100 KDa, 75–85% wedi'i ddadasetyleiddio) gan Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). Prynwyd sodiwm tripolyfosffad (TPP) gan VWR (Radnor, Pennsylvania, UDA). Defnyddiwyd inswlin dynol ailgyfunol yn yr astudiaeth hon gan Fisher Scientific (Waltham, MA, UDA). Prynwyd inswlin dynol wedi'i labelu â fflworescein isothiocyanate (FITC) a 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydroclorid (DAPI) gan Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). Cafwyd y llinell gelloedd HepG2 gan ATCC (Manassas, Virginia, UDA). Roedd yr holl adweithyddion eraill o radd dadansoddol neu gromatograffig.
Paratowch doddiant CS 1 mg/ml trwy ei doddi mewn dŵr wedi'i ddistyllu ddwywaith (dŵr DD) sy'n cynnwys 0.1% asid asetig. Paratowch doddiannau 1 mg/ml o TPP ac inswlin trwy eu doddi mewn dŵr DD a 0.1% asid asetig, yn y drefn honno. Paratowyd y rhag-emwlsiwn gyda homogeneiddiwr cyflymder uchel polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, UDA). Dyma'r broses baratoi: yn gyntaf, ychwanegir 2ml o doddiant TPP at 4ml o doddiant inswlin, ac mae'r cymysgedd yn cael ei droi am 30 munud a'i gymysgu'n llwyr. Yna, ychwanegwyd yr doddiant cymysg fesul diferyn at y toddiant CS trwy chwistrell o dan droi cyflymder uchel (10,000 rpm). Cadwyd y cymysgeddau o dan droi cyflymder uchel (15,000 rpm) mewn baddon iâ am 30 munud, a chawsant eu haddasu i pH penodol i gael NPs inswlin wedi'u cysylltu'n groes. I homogeneiddio ymhellach a lleihau maint gronynnau NPs inswlin, cawsant eu soniceiddio am... 30 munud ychwanegol mewn baddon iâ gan ddefnyddio sonicator math stiliwr (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, yr Almaen).
Profwyd NPS inswlin am ddiamedr cyfartalog Z, mynegai polydispersity (PDI) a photensial zeta gan ddefnyddio mesuriadau gwasgariad golau deinamig (DLS) gan ddefnyddio Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Awstria) trwy eu gwanhau mewn dŵr DD ar 25°C. Nodweddwyd morffoleg a dosbarthiad maint gan ficrosgop electron trosglwyddo (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan), ac yna dadansoddwyd delweddau gan ddefnyddio meddalwedd delweddu Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japan). I asesu effeithlonrwydd capsiwleiddio (EE) a chynhwysedd llwytho (LC) NPs inswlin, pipedwyd yr NPs i diwbiau uwch-hidlo gyda therfyn pwysau moleciwlaidd o 100 kDa a'u centrifugio ar 500 xg am 30 munud. Mesurwyd inswlin heb ei gapsiwleiddio yn yr hidlydd gan ddefnyddio system HPLC Cyfres 1100 Agilent (Agilent, Santa Clara, California, UDA) yn cynnwys pwmp cwaternaidd, samplwr awtomatig, gwresogydd colofn, a DAD. synhwyrydd. Dadansoddwyd inswlin gan ddefnyddio colofn C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, UDA) a'i ganfod ar 214 nm. Y cyfnod symudol oedd asetonitril a dŵr, yn cynnwys 0.1% TFA, cymhareb graddiant o 10/90 i 100/0, a'i redeg am 10 munud. Pwmpiwyd y cyfnod symudol ar gyfradd llif o 1.0 ml/mun. Gosodwyd tymheredd y golofn i 20 °C. Cyfrifwch ganrannau EE ac LC gan ddefnyddio'r hafaliadau (1) a Hafaliad (2).
Profwyd amrywiol gymhareb CS/inswlin yn amrywio o 2.0 i 4.0 i optimeiddio NP inswlin. Ychwanegwyd gwahanol symiau o doddiant CS yn ystod y paratoad, tra bod y cymysgedd inswlin/TPP yn cael ei gadw'n gyson. Paratowyd NPs inswlin yn yr ystod pH o 4.0 i 6.5 trwy reoli pH y cymysgedd yn ofalus ar ôl ychwanegu'r holl doddiannau (inswlin, TPP a CS). Gwerthuswyd EE a maint gronynnau nanoronynnau inswlin ar wahanol werthoedd pH a chymhareb màs CS/inswlin i optimeiddio ffurfio NPs inswlin.
Gosodwyd y nanoparthau inswlin wedi'u optimeiddio ar y cynhwysydd alwminiwm a'u gorchuddio â meinwe wedi'i dynhau â rhywfaint o dâp. Wedi hynny, gosodwyd y cynwysyddion wedi'u sgriwio mewn sychwr rhewi Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, UDA) a oedd â sychwr hambwrdd. Gosodwyd y tymheredd a'r pwysau gwactod ar -10 °C, 0.350 Torr am y 2 awr gyntaf, a 0 °C a 0.120 Torr am y 22 awr sy'n weddill o'r 24 awr i gael nanoparthau inswlin sych.
Defnyddiwyd Sychwr Chwistrell Mini Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, y Swistir) i gynhyrchu inswlin wedi'i gapsiwleiddio. Y paramedrau sychu a ddewiswyd oedd: tymheredd 100 °C, llif porthiant 3 L/mun, a llif nwy 4 L/mun.
Nodweddwyd nanoronynnau inswlin cyn ac ar ôl dadhydradu gan ddefnyddio sbectrosgopeg FTIR-ATR. Dadansoddwyd nanoronynnau dadhydradedig yn ogystal ag inswlin a chitosan rhydd gan ddefnyddio sbectroffotomedr Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, UDA) a oedd â chyfarpar samplu ATR cyffredinol (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, UDA). Cafwyd cyfartaleddau signal o 16 sgan ar benderfyniad o 4 cm2 yn yr ystod amledd o 4000-600 cm2.
Aseswyd morffoleg nanopartiau inswlin sych gan ddefnyddio delweddau SEM o nanopartiau inswlin wedi'u rhewi-sychu a'u chwistrell-sychu a ddaliwyd gan Ficrosgop Electron Sganio Trawst Ion Ffocysedig Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, UDA). Y prif baramedr a ddefnyddiwyd oedd foltedd 5 keV a cherrynt 30 mA.
Ail-ddiddymwyd yr holl NPs inswlin dadhydradedig mewn dŵr dd. Profwyd maint y gronynnau, PDI, EE ac LC eto gan ddefnyddio'r un dull a grybwyllwyd yn gynharach i asesu eu hansawdd ar ôl dadhydradu. Mesurwyd sefydlogrwydd NPs anhydroinswlin hefyd trwy brofi priodweddau'r NPs ar ôl eu storio am gyfnod hir. Yn yr astudiaeth hon, storiwyd yr holl NPs ar ôl dadhydradu yn yr oergell am dri mis. Ar ôl tri mis o storio, profwyd NPs am faint gronynnau morffolegol, PDI, EE ac LC.
Toddwch 5 mL o NPs wedi'u hailgyfansoddi mewn 45 mL sy'n cynnwys hylif gastrig efelychiedig (pH 1.2, sy'n cynnwys 1% pepsin), hylif berfeddol (pH 6.8, sy'n cynnwys 1% trypsin) neu doddiant chymotrypsin (100 g/mL, mewn byffer ffosffad, pH 7.8) i werthuso effeithiolrwydd inswlin wrth amddiffyn NPs ar ôl dadhydradu. Cawsant eu magu ar 37°C gyda chyflymder cynnwrf o 100 rpm. Casglwyd 500 μL o'r toddiant ar wahanol bwyntiau amser a phennwyd crynodiad yr inswlin gan HPLC.
Profwyd ymddygiad rhyddhau in vitro NPs inswlin newydd eu paratoi a'u dadhydradu gan ddefnyddio'r dull bag dialysis (torbwynt pwysau moleciwlaidd 100 kDa, Spectra Por Inc.). Cafodd NPs sych newydd eu paratoi a'u hailgyfansoddi eu dialysu mewn hylifau ar pH 2.5, pH 6.6, a pH 7.0 (hallwyn wedi'i glustogi â ffosffad 0.1 M, PBS) i efelychu amgylchedd pH y stumog, y dwodenwm, a'r coluddyn bach uchaf, yn y drefn honno. Cafodd pob sampl ei ddeori ar 37 °C gyda ysgwyd parhaus ar 200 rpm. Anadlwch yr hylif y tu allan i'r bag dialysis 5 mL ar yr adegau canlynol: 0.5, 1, 2, 3, 4, a 6 awr, ac ailgyflenwi'r gyfaint ar unwaith gyda dialysad ffres. Dadansoddwyd halogiad inswlin yn yr hylif gan HPLC, a chyfrifwyd cyfradd rhyddhau inswlin o'r nanoronynnau o'r gymhareb o inswlin rhydd a ryddhawyd i gyfanswm yr inswlin wedi'i gapsiwleiddio yn y nanoronynnau (Hafaliad 3).
Tyfwyd celloedd HepG2 llinell celloedd carsinoma hepatocellwlaidd dynol mewn dysglau 60 mm o ddiamedr gan ddefnyddio Cyfrwng Eryr wedi'i Addasu Dulbecco (DMEM) yn cynnwys 10% serwm buchol ffetws, 100 IU/mL penisilin, a 100 μg/mL streptomycin29. Cadwyd diwylliannau ar 37°C, 95% lleithder cymharol, a 5% CO2. Ar gyfer asesiadau cymeriant, hauwyd celloedd HepG2 ar 1 × 105 celloedd/ml ar system sleidiau siambr Nunc Lab-Tek 8-ffynnon (Thermo Fisher, NY, UDA). Ar gyfer asesiadau cytotocsinedd, hauwyd hwy i blatiau 96-ffynnon (Corning, NY, UDA) ar ddwysedd o 5 × 104 celloedd/ml.
Defnyddiwyd yr assay MTT i werthuso cytotocsinedd NPs inswlin newydd eu paratoi a'u dadhydradu30. Hadwyd celloedd HepG2 mewn platiau 96-ffynnon ar ddwysedd o 5 × 104 celloedd/mL a'u meithrin am 7 diwrnod cyn profi. Gwanhawyd NPs inswlin i wahanol grynodiadau (50 i 500 μg/mL) mewn cyfrwng diwylliant ac yna eu rhoi i gelloedd. Ar ôl 24 awr o ddeori, golchwyd celloedd 3 gwaith gyda PBS a'u meithrin gyda chyfrwng yn cynnwys 0.5 mg/ml MTT am 4 awr ychwanegol. Aseswyd cytotocsinedd trwy fesur y gostyngiad ensymatig o MTT tetrazoliwm melyn i formazan porffor ar 570 nm gan ddefnyddio darllenydd platiau sbectroffotomedr Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, y Swistir).
Profwyd effeithlonrwydd cymeriant cellog NPs trwy ficrosgopeg sganio laser confocal a dadansoddiad cytometry llif. Cafodd pob ffynnon o system sleidiau siambr Nunc Lab-Tek ei drin ag inswlin FITC rhydd, NPs wedi'u llwytho ag inswlin FITC, ac ailgyfansoddwyd 25 μg/mL o NPs inswlin FITC dadhydradedig ar yr un crynodiad a'u deori am 4 awr. Golchwyd celloedd 3 gwaith gyda PBS a'u trwsio â 4% paraformaldehyd. Staeniwyd niwclei â 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Arsylwyd lleoleiddio inswlin gan ddefnyddio microsgop confocal sganio laser/dau-ffoton Olympus FV1000 (Olympus, Dinas Shinjuku, Tokyo, Japan). Ar gyfer dadansoddiad cytometry llif, ychwanegwyd yr un crynodiadau o 10 μg/mL o inswlin FITC rhydd, NPs wedi'u llwytho ag inswlin FITC, a NPs inswlin FITC dadhydradedig wedi'u hail-hydoddi at blatiau 96-ffynnon wedi'u hau â chelloedd HepG2 a'u deori am 4 awr. Ar ôl 4 awr o ddeori, tynnwyd celloedd a'u golchi 3 gwaith gyda FBS. Dadansoddwyd 5 × 104 o gelloedd fesul sampl gan cytometr llif BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Unol Daleithiau America).
Mynegir pob gwerth fel cymedr ± gwyriad safonol. Aseswyd cymariaethau rhwng yr holl grwpiau gan ddefnyddio ANOVA unffordd neu brawf-t gan IBM SPSS Statistics 26 ar gyfer Mac (IBM, Endicott, Efrog Newydd, UDA) ac ystyriwyd bod p < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.
Mae'r astudiaeth hon yn dangos hyblygrwydd a gallu sychu chwistrell i ddadhydradu nanoronynnau chitosan/TPP/inswlin trawsgysylltiedig gyda gwell ailgyfansoddi o'i gymharu â dulliau rhewi-sychu safonol gan ddefnyddio asiantau swmpio neu gapasiti cryo-amddiffynwyr a chapasiti llwyth uwch. Cynhyrchodd y nanoronynnau inswlin wedi'u optimeiddio faint gronynnau cyfartalog o 318 nm ac effeithlonrwydd capsiwleiddio o 99.4%. Dangosodd canlyniadau SEM ac FTIR ar ôl dadhydradu mai dim ond mewn NPs wedi'u sychu â chwistrell gyda a heb mannitol ac wedi'u lyoffilio â mannitol y cynhaliwyd y strwythur sfferig, ond cafodd NPs wedi'u lyoffilio heb mannitol eu dadelfennu yn ystod dadhydradu. Yn y prawf gallu ailgyfansoddi, dangosodd nanoronynnau inswlin wedi'u sychu â chwistrell heb mannitol y maint gronynnau cymedrig lleiaf a'r llwyth uchaf ar ôl ailgyfansoddi. Dangosodd ymddygiadau rhyddhau'r holl NPs dadhydradedig hyn eu bod wedi'u rhyddhau'n gyflym mewn toddiannau pH = 2.5 a pH = 7, ac yn sefydlog iawn mewn toddiant pH = 6.5. O'i gymharu â NPs dadhydradedig eraill wedi'u hail-ddiddymu, roedd y NPs... dangosodd sychu chwistrell heb fanitol y rhyddhau cyflymaf. Mae'r canlyniad hwn yn gyson â'r hyn a welwyd yn yr assay amsugno cellog, gan fod NPs sychu chwistrell heb fanitol wedi cynnal effeithlonrwydd amsugno cellog NPs ffres wedi'u paratoi bron yn llwyr. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod nanoronynnau inswlin sych a baratowyd trwy sychu chwistrell heb fanitol yn fwyaf addas ar gyfer prosesu pellach i ffurfiau dos anhydrus eraill, megis tabledi geneuol neu ffilmiau biogludiog.
Oherwydd problemau eiddo deallusol, nid yw'r setiau data a gynhyrchwyd a/neu a ddadansoddwyd yn ystod yr astudiaeth gyfredol ar gael i'r cyhoedd, ond maent ar gael gan yr awduron priodol ar gais rhesymol.
Kagan, A. Diabetes math 2: tarddiad cymdeithasol a gwyddonol, cymhlethdodau meddygol, a goblygiadau i gleifion ac eraill. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. a Jiang, P. Datblygu capsiwleiddio inswlin: a yw gweinyddiaeth lafar bellach yn bosibl?J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. a Dass, CR Datblygiadau diweddar mewn systemau dosbarthu liposom sy'n llawn inswlin ar lafar ar gyfer trin diabetes. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).