Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn o borwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y canlyniadau gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio fersiwn newydd o'ch porwr (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb steilio na JavaScript.
Defnyddir asid propionig (PPA) i astudio rôl camweithrediad mitocondriaidd mewn anhwylderau niwroddatblygiadol fel anhwylder sbectrwm awtistiaeth. Gwyddys bod PPA yn tarfu ar fiogenesis, metaboledd a throsiant mitocondriaidd. Fodd bynnag, mae effeithiau PPA ar ddeinameg, ymholltiad ac ymasiad mitocondriaidd yn parhau i fod yn broblemus oherwydd natur amserol gymhleth y mecanweithiau hyn. Yma, rydym yn defnyddio technegau delweddu meintiol cyflenwol i ymchwilio i sut mae PPA yn effeithio ar uwchstrwythur, morffoleg a deinameg mitocondriaidd mewn celloedd SH-SY5Y tebyg i niwronau. Achosodd PPA (5 mM) ostyngiad sylweddol yn arwynebedd mitocondriaidd (p < 0.01), diamedr a chylchedd y ffuret (p < 0.05), ac arwynebedd 2 (p < 0.01). Dangosodd dadansoddiad lleolwr digwyddiadau mitocondriaidd gynnydd sylweddol (p < 0.05) mewn digwyddiadau ymholltiad ac ymasiad, a thrwy hynny gynnal cyfanrwydd y rhwydwaith mitocondriaidd o dan amodau straen. Yn ogystal, gostyngwyd mynegiant mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ac OPA1 (p < 0.05) yn sylweddol. 01). Mae hyn yn dangos ailfodelu morffoleg, biogenesis a dynameg mitocondriaidd i gynnal swyddogaeth o dan amodau straen. Mae ein data yn rhoi cipolwg newydd ar effeithiau PPA ar ddeinameg mitocondriaidd ac yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb technegau delweddu ar gyfer astudio'r mecanweithiau rheoleiddio cymhleth sy'n gysylltiedig ag ymatebion straen mitocondriaidd.
Mae mitochondria yn gyfranogwyr annatod mewn amrywiaeth o swyddogaethau cellog y tu hwnt i'w rolau nodweddiadol mewn cynhyrchu ynni a biosynthesis. Mae metaboledd mitochondrial yn rheolydd allweddol o signalau calsiwm, homeostasis metabolaidd a redoks, signalau llidiol, addasiadau epigenetig, amlhau celloedd, gwahaniaethu a marwolaeth celloedd wedi'i raglennu1. Yn benodol, mae metaboledd mitocondriaidd yn hanfodol ar gyfer datblygiad, goroesiad a swyddogaeth niwronau ac mae'n gysylltiedig yn helaeth ag amrywiol amlygiadau o niwropatholeg2,3,4.
Dros y degawd diwethaf, mae statws metabolig wedi dod i'r amlwg fel rheolydd canolog niwrogenesis, gwahaniaethu, aeddfedu a phlastigedd5,6. Yn ddiweddar, mae morffoleg a dynameg mitocondriaidd wedi dod yn gydrannau arbennig o bwysig o mitosis, proses ddeinamig sy'n cynnal cronfa o fiocondria iach o fewn celloedd. Mae dynameg mitocondriaidd yn cael eu rheoleiddio gan lwybrau rhyngddibynnol cymhleth yn amrywio o fiogenesis a bio-ynergeteg mitocondriaidd i ymholltiad, uno, cludo a chlirio mitocondriaidd7,8. Mae tarfu ar unrhyw un o'r mecanweithiau integreiddiol hyn yn amharu ar gynnal rhwydweithiau mitocondriaidd iach ac mae ganddo ganlyniadau swyddogaethol dwys ar gyfer niwroddatblygiad9,10. Yn wir, gwelir camreoleiddio dynameg mitocondriaidd mewn llawer o anhwylderau seiciatrig, niwroddirywiol a niwroddatblygiadol, gan gynnwys anhwylderau sbectrwm awtistiaeth (ASD)11,12.
Mae ASD yn anhwylder niwroddatblygiadol heterogenaidd gyda phensaernïaeth genetig ac epigenetig gymhleth. Mae etifeddiaeth ASD yn ddiamheuol, ond mae'r etioleg foleciwlaidd sylfaenol yn parhau i fod yn cael ei deall yn wael. Mae data cronedig o fodelau cyn-glinigol, astudiaethau clinigol, a setiau data moleciwlaidd aml-omig yn darparu tystiolaeth gynyddol o gamweithrediad mitocondriaidd yn ASD13,14. Yn flaenorol, fe wnaethom gynnal sgrin methyliad DNA genom-eang mewn carfan o gleifion ag ASD ac adnabod genynnau wedi'u methyleiddio'n wahaniaethol wedi'u clystyru ar hyd llwybrau metabolaidd mitocondriaidd15. Wedi hynny, fe wnaethom adrodd am fethyliad gwahaniaethol rheoleiddwyr canolog biogenesis a dynameg mitocondriaidd, a oedd yn gysylltiedig â nifer copïau mtDNA cynyddol a phroffil metabolaidd wrinol wedi'i newid yn ASD16. Mae ein data yn darparu tystiolaeth gynyddol bod dynameg mitocondriaidd a homeostasis yn chwarae rhan ganolog ym patholeg ASD. Felly, mae gwella'r ddealltwriaeth fecanistig o'r berthynas rhwng dynameg, morffoleg a swyddogaeth mitocondriaidd yn nod allweddol i ymchwil barhaus i glefydau niwrolegol a nodweddir gan gamweithrediad mitocondriaidd eilaidd.
Defnyddir technegau moleciwlaidd yn aml i astudio rôl genynnau penodol mewn ymatebion straen mitocondriaidd. Fodd bynnag, gall y dull hwn gael ei gyfyngu gan natur amlochrog ac amserol mecanweithiau rheoli mitotig. Ar ben hynny, mae mynegiant gwahaniaethol genynnau mitocondriaidd yn ddangosydd anuniongyrchol o newidiadau swyddogaethol, yn enwedig gan mai dim ond nifer gyfyngedig o enynnau sy'n cael eu dadansoddi fel arfer. Felly, cynigiwyd dulliau mwy uniongyrchol ar gyfer astudio swyddogaeth mitocondriaidd a bio-ynni17. Mae morffoleg mitocondriaidd yn gysylltiedig yn agos â dynameg mitocondriaidd. Mae siâp, cysylltedd a strwythur mitocondriaidd yn hanfodol ar gyfer cynhyrchu ynni a goroesiad mitocondriaidd a chelloedd5,18. Ar ben hynny, mae gwahanol gydrannau mitosis yn canolbwyntio ar newidiadau mewn morffoleg mitocondriaidd, a all wasanaethu fel pwyntiau terfyn defnyddiol o gamweithrediad mitocondriaidd a darparu sail ar gyfer astudiaethau mecanistig dilynol.
Gellir arsylwi morffoleg mitocondriaidd yn uniongyrchol gan ddefnyddio microsgopeg electron trosglwyddo (TEM), gan ganiatáu astudiaeth fanwl o uwchstrwythur cellog. Mae TEM yn delweddu morffoleg, siâp a strwythur cristae mitocondriaidd yn uniongyrchol ar benderfyniad mitochondria unigol, yn hytrach na dibynnu'n llwyr ar drawsgrifiad genynnau, mynegiant protein neu baramedrau swyddogaethol mitocondriaidd mewn poblogaethau celloedd17,19,20. Yn ogystal, mae TEM yn hwyluso astudiaeth o ryngweithiadau rhwng mitochondria ac organynnau eraill, fel y reticwlwm endoplasmig ac awtoffagosomau, sy'n chwarae rolau allweddol mewn swyddogaeth mitocondriaidd a homeostasis21,22. Felly, mae hyn yn gwneud TEM yn fan cychwyn da ar gyfer astudio camweithrediad mitocondriaidd cyn canolbwyntio ar lwybrau neu enynnau penodol. Wrth i swyddogaeth mitocondriaidd ddod yn fwyfwy perthnasol i niwropatholeg, mae angen clir i allu astudio morffoleg a deinameg mitocondriaidd yn uniongyrchol ac yn feintiol mewn modelau niwronau in vitro.
Yn yr erthygl hon, rydym yn archwilio dynameg mitocondriaidd mewn model niwronaidd o gamweithrediad mitocondriaidd mewn anhwylder sbectrwm awtistiaeth. Fe wnaethom adrodd yn flaenorol am fethyleiddio gwahaniaethol propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) yn ASD15, is-uned o'r ensym mitocondriaidd propionyl-CoA carboxylase PCC. Gwyddys bod camreoleiddio PCC yn achosi croniad gwenwynig o ddeilliadau propionyl, gan gynnwys asid propionig (PPA)23,24,25. Dangoswyd bod PPA yn tarfu ar fetaboledd niwronaidd ac yn newid ymddygiad in vivo ac mae'n fodel anifail sefydledig ar gyfer astudio mecanweithiau niwroddatblygiadol sy'n gysylltiedig ag ASD26,27,28. Yn ogystal, adroddwyd bod PPA yn tarfu ar botensial pilen mitocondriaidd, biogenesis ac anadlu in vitro ac fe'i defnyddiwyd yn helaeth i fodelu camweithrediad mitocondriaidd mewn niwronau29,30. Fodd bynnag, mae effaith camweithrediad mitocondriaidd a achosir gan PPA ar forffoleg a dynameg mitocondriaidd yn parhau i fod heb ei ddeall yn dda.
Mae'r astudiaeth hon yn defnyddio technegau delweddu cyflenwol i fesur effeithiau PPA ar forffoleg, dynameg a swyddogaeth mitocondriaidd mewn celloedd SH-SY5Y. Yn gyntaf, fe wnaethom ddatblygu dull TEM i ddelweddu newidiadau mewn morffoleg ac uwchstrwythur mitocondriaidd17,31,32. O ystyried natur ddeinamig mitochondria33, fe wnaethom hefyd ddefnyddio dadansoddiad lleoleiddiwr digwyddiadau mitocondriaidd (MEL) i fesur newidiadau yn y cydbwysedd rhwng digwyddiadau ymholltiad ac ymasiad, nifer a chyfaint mitocondriaidd o dan straen PPA. Yn olaf, fe wnaethom archwilio a yw morffoleg a dynameg mitocondriaidd yn gysylltiedig â newidiadau yn mynegiant genynnau sy'n ymwneud â biogenesis, ymholltiad ac ymasiad. Gyda'i gilydd, mae ein data yn dangos yr her o egluro cymhlethdod y mecanweithiau sy'n rheoleiddio dynameg mitocondriaidd. Rydym yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb TEM wrth astudio morffoleg mitocondriaidd fel pwynt terfyn cydgyfeiriol mesuradwy o mitosis mewn celloedd SH-SY5Y. Yn ogystal, rydym yn tynnu sylw at y ffaith bod data TEM yn darparu'r wybodaeth gyfoethocaf pan gaiff ei gyfuno â thechnegau delweddu sydd hefyd yn dal digwyddiadau deinamig mewn ymateb i straen metabolaidd. Gall nodweddu ymhellach y mecanweithiau rheoleiddio moleciwlaidd sy'n cefnogi mitosis celloedd niwronaidd ddarparu cipolwg pwysig ar gydran mitocondriaidd y system nerfol a chlefydau niwroddirywiol.
I ysgogi straen mitocondriaidd, cafodd celloedd SH-SY5Y eu trin â PPA gan ddefnyddio propionad sodiwm (NaP) 3 mM a 5 mM. Cyn TEM, cafodd samplau eu paratoi'n cryogenig gan ddefnyddio rhewi a rhewi pwysedd uchel (Ffig. 1a). Fe wnaethom ddatblygu piblinell dadansoddi delweddau mitocondriaidd awtomataidd i fesur wyth paramedr morffolegol o boblogaethau mitocondriaidd ar draws tri dyblygiad biolegol. Fe wnaethom ganfod bod triniaeth PPA wedi newid pedwar paramedr yn sylweddol: arwynebedd 2, arwynebedd, perimedr, a diamedr Feret (Ffig. 1b–e). Gostyngodd arwynebedd 2 yn sylweddol gyda thriniaeth PPA 3 mM a 5 mM (p = 0.0183 a p = 0.002, yn y drefn honno) (Ffig. 1b), tra bod arwynebedd (p = 0.003), perimedr (p = 0.0106) a diamedr Feret i gyd wedi gostwng yn sylweddol. Roedd gostyngiad sylweddol (p = 0.0172) yn y grŵp triniaeth 5 mM o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. 1c–e). Dangosodd gostyngiadau sylweddol mewn arwynebedd a chylchedd fod gan gelloedd a gafodd eu trin â 5 mM PPA mitochondria llai, mwy crwn, a bod y mitochondria hyn yn llai hirgul na'r rhai mewn celloedd rheoli. Mae hyn hefyd yn gyson â gostyngiad sylweddol yn ndiamedr Feret, paramedr annibynnol sy'n dynodi gostyngiad yn y pellter mwyaf rhwng ymylon gronynnau. Gwelwyd newidiadau yn uwchstrwythur y cristae: daeth y cristae yn llai amlwg o dan ddylanwad straen PPA (Ffig. 1a, panel B). Fodd bynnag, nid oedd pob delwedd yn adlewyrchu uwchstrwythur y cristae yn glir, felly ni chynhaliwyd dadansoddiad meintiol o'r newidiadau hyn. Gall y data TEM hyn adlewyrchu tri senario posibl: (1) mae PPA yn gwella ymholltiad neu'n atal uno, gan achosi i mitochondria presennol grebachu o ran maint; (2) mae biogenesis gwell yn creu mitochondria newydd, llai neu (3) mae'n ysgogi'r ddau fecanwaith ar yr un pryd. Er na ellir gwahaniaethu'r amodau hyn gan TEM, mae newidiadau morffolegol sylweddol yn dynodi newidiadau mewn homeostasis a dynameg mitocondriaidd o dan straen PPA. Wedi hynny, archwiliwyd paramedrau ychwanegol i nodweddu'r dynameg hyn ymhellach a'r mecanweithiau posibl sy'n sail iddynt.
Mae asid propionig (PPA) yn ailfodelu morffoleg mitocondriaidd. (a) Delweddau microsgopeg electron trosglwyddo (TEM) cynrychioliadol yn dangos bod maint mitocondriaidd yn lleihau a mitocondriaidd yn dod yn llai ac yn fwy crwn gyda chynnydd mewn triniaeth PPA; 0 mM (heb ei drin), 3 mM a 5 mM, yn y drefn honno. Mae saethau coch yn dynodi mitocondriaidd. (b–e) Paratowyd celloedd SH-SY5Y a gafodd eu trin â PPA am 24 awr ar gyfer TEM a dadansoddwyd y canlyniadau gan ddefnyddio Fiji/ImageJ. Dangosodd pedwar o'r wyth paramedr wahaniaethau sylweddol rhwng celloedd rheoli (heb eu trin, 0 mM PPA) a chelloedd wedi'u trin (3 mM a 5 mM PPA). (b) Rhanbarth 2, (c) Arwynebedd, (d) Perimedr, (e) Diamedr y ffwret. Defnyddiwyd dadansoddiad unffordd o amrywiant (rheolaeth vs. triniaeth) a phrawf cymhariaeth lluosog Dunnett i bennu gwahaniaethau sylweddol (p < 0.05). Mae pwyntiau data yn cynrychioli'r gwerth mitocondriaidd cyfartalog ar gyfer pob cell unigol, ac mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± SEM. Mae'r data a ddangosir yn cynrychioli n = 3, o leiaf 24 cell fesul dyblygiad; dadansoddwyd cyfanswm o 266 o ddelweddau; * yn dynodi p < 0.05, ** yn dynodi p < 0.01.
I nodweddu ymhellach sut mae dynameg mitocondriaidd yn ymateb i PPA, fe wnaethom staenio mitocondria ag ester ethyl tetramethylrhodamine (TMRE) a defnyddio microsgopeg amser-dros-amser a dadansoddiad MEL i leoleiddio a meintioli mitocondria ar ôl 24 awr ar PPA 3 a 5 mM. Trin digwyddiadau ymholltiad ac ymasiad. (Ffig. 2a). Ar ôl dadansoddiad MEL, dadansoddwyd mitocondria ymhellach i feintioli nifer y strwythurau mitocondriaidd a'u cyfaint cyfartalog. Gwelsom gynnydd bach ond arwyddocaol yn nifer y digwyddiadau ymholltiad a ddigwyddodd ar 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] o'i gymharu â digwyddiadau ymholltiad [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] ac ymasiad [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ac ymasiad [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] wedi cynyddu'n sylweddol ar 5 mM o'i gymharu â'r rheolydd (Ffig. 3b). Cynyddodd nifer y mitochondria yn sylweddol ar 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] a 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Ffig. 3c), tra bod cyfaint cyfartalog pob strwythur mitocondriaidd wedi aros yr un fath (Ffig. 3c). 3d). Gyda'i gilydd, mae hyn yn awgrymu bod ailfodelu dynameg mitocondriaidd yn gweithredu fel ymateb iawndal sy'n cynnal cyfanrwydd y rhwydwaith mitocondriaidd yn llwyddiannus. Mae'r cynnydd yn nifer y digwyddiadau ymhollti ar 3 mM PPA yn awgrymu bod y cynnydd yn nifer y mitocondriaidd yn rhannol oherwydd ymholltiad mitocondriaidd, ond o ystyried bod cyfaint cyfartalog mitocondriaidd yn parhau i fod yr un fath i raddau, ni ellir diystyru biogenesis fel ymateb iawndal ychwanegol. Fodd bynnag, mae'r data hyn yn gyson â'r strwythurau mitocondriaidd crwn llai a welwyd gan TEM ac maent hefyd yn dangos newidiadau sylweddol mewn dynameg mitocondriaidd a achosir gan PPA.
Mae asid propionig (PPA) yn ysgogi ailfodelu mitocondriaidd deinamig i gynnal cyfanrwydd y rhwydwaith. Cafodd celloedd SH-SY5Y eu meithrin, eu trin â PPA 3 a 5 mM am 24 awr a'u staenio â TMRE a Hoechst 33342 ac yna dadansoddiad MEL. (a) Delweddau microsgopeg amser-dreigl cynrychioliadol sy'n darlunio lliw a rhagamcanion dwyster uchaf deuaidd ar amser 2 (t2) ar gyfer pob cyflwr. Mae rhanbarthau dethol a nodir ym mhob delwedd ddeuaidd wedi'u gwella a'u harddangos mewn 3D ar dair ffrâm amser wahanol (t1-t3) i ddangos y deinameg dros amser; mae digwyddiadau cyfuno wedi'u hamlygu mewn gwyrdd; mae digwyddiadau ymhollti wedi'u hamlygu mewn gwyrdd. Wedi'u harddangos mewn coch. (b) Nifer cyfartalog o ddigwyddiadau deinamig fesul cyflwr. (c) Nifer cyfartalog o strwythurau mitocondriaidd fesul cell. (d) Cyfaint cyfartalog (µm3) pob strwythur mitocondriaidd fesul cell. Mae'r data a ddangosir yn gynrychioliadol o n = 15 cell fesul grŵp triniaeth. Mae'r bariau gwall a ddangosir yn cynrychioli cymedr ± SEM, bar graddfa = 10 μm, * p < 0.05.
Mae asid propionig (PPA) yn achosi ataliad trawsgrifio genynnau sy'n gysylltiedig â dynameg mitocondriaidd. Cafodd celloedd SH-SY5Y eu trin â PPA 3 a 5 mM am 24 awr. Perfformiwyd meintioli genynnau cymharol gan ddefnyddio RT-qPCR a'i normaleiddio i B2M. Genynnau biogenesis mitocondriaidd (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 a (d) NFE2L2. Genynnau ymasiad a hollti mitocondriaidd (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 a (i) DRP1. Profwyd gwahaniaethau arwyddocaol (p < 0.05) gan ddefnyddio ANOVA unffordd (rheolaeth vs. triniaeth) a phrawf cymhariaeth lluosog Dunnett: * yn dynodi p < 0.05, ** yn dynodi p < 0.01, ac **** yn dynodi p < 0.0001. Mae bariau'n cynrychioli mynegiant cymedrig ± SEM. Mae'r data a ddangosir yn cynrychioli atgynhyrchiadau biolegol n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ac n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Mae data o ddadansoddiadau TEM a MEL gyda'i gilydd yn dangos bod PPA yn newid morffoleg a dynameg mitocondriaidd. Fodd bynnag, nid yw'r technegau delweddu hyn yn rhoi cipolwg ar y mecanweithiau sylfaenol sy'n gyrru'r prosesau hyn. Felly, fe wnaethom archwilio mynegiant mRNA naw rheolydd allweddol o ddeinameg mitocondriaidd, biogenesis, a mitosis mewn ymateb i driniaeth PPA. Fe wnaethom fesur oncogene myeloma celloedd (cMYC), ffactor anadlol niwclear (NRF1), ffactor trawsgrifio mitocondriaidd 1 (TFAM), ffactor trawsgrifio tebyg i NFE2 BZIP (NFE2L2), protein tebyg i gastrin 2 (STOML2), atroffi nerf optig 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) a phrotein 1 sy'n gysylltiedig â dynamin (DRP1) ar ôl 24 awr o driniaeth gyda PPA 3 mM a 5 mM. Gwelsom driniaeth PPA o 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 a p < 0.0001, yn y drefn honno) a 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Ffig. 3a–c). Roedd y gostyngiad yn mynegiant mRNA yn ddibynnol ar y dos: gostyngodd mynegiant cMYC, NRF1 a TFAM 5.7, 2.6 ac 1.9 gwaith ar 3 mM, yn y drefn honno, ac 11.2, 3 a 2.2 gwaith ar 5 mM. Mewn cyferbyniad, ni newidiwyd y genyn biogenesis redox canolog NFE2L2 ar unrhyw grynodiad o PPA, er y gwelwyd tuedd debyg o ostyngiad yn y mynegiant sy'n ddibynnol ar y dos (Ffig. 3d).
Fe wnaethom hefyd archwilio mynegiant genynnau clasurol sy'n ymwneud â rheoleiddio ymholltiad ac ymasiad. Credir bod STOML2 yn ymwneud ag ymasiad, mitoffagiaeth a biogenesis, a gostyngwyd ei fynegiant yn sylweddol (p < 0.0001) gan 3 mM (newid 2.4 gwaith) a 5 mM (newid 2.8 gwaith) PPA (Ffig. 1). 3d). Yn yr un modd, gostyngwyd mynegiant genyn ymasiad OPA1 ar 3 mM (newid 1.6 gwaith) a 5 mM (newid 1.9 gwaith) PPA (p = 0.006 a p = 0.0024, yn y drefn honno) (Ffig. 3f). Fodd bynnag, ni chanfuom wahaniaethau sylweddol yn mynegiant genynnau ymasiad MFN1, MFN2 neu genyn ymholltiad DRP1 o dan straen PPA 24 awr (Ffig. 3g–i). Yn ogystal, gwelsom nad oedd lefelau pedwar protein ymasiad a hollti (OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1) wedi newid o dan yr un amodau (Ffig. 4a–d). Mae'n bwysig nodi bod y data hyn yn adlewyrchu un pwynt mewn amser ac efallai nad ydynt yn adlewyrchu newidiadau mewn mynegiant protein neu lefelau gweithgaredd yn ystod camau cynnar straen PPA. Fodd bynnag, mae gostyngiadau sylweddol yn mynegiant cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ac OPA1 yn dynodi dadreoleiddio trawsgrifio sylweddol o fetaboledd, biogenesis a dynameg mitocondriaidd. Yn ogystal, mae'r data hyn yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb technegau delweddu i astudio newidiadau cyflwr terfynol mewn swyddogaeth mitocondriaidd yn uniongyrchol.
Ni newidiodd lefelau protein ymasiad a ffactor ymholltiad ar ôl triniaeth asid propionig (PPA). Cafodd celloedd SH-SY5Y eu trin â PPA 3 a 5 mM am 24 awr. Mesurwyd lefelau protein trwy ddadansoddiad blot Western, a normaleiddiwyd lefelau mynegiant i gyfanswm protein. Dangosir mynegiant protein cyfartalog a blotiau Western cynrychioliadol o brotein targed a chyfanswm protein. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Mae'r bariau'n cynrychioli cymedr ± SEM, ac mae'r data a ddangosir yn gynrychioliadol o n = 3 dyblygiad biolegol. Perfformiwyd cymhariaethau lluosog (p < 0.05) gan ddefnyddio dadansoddiad amrywiant unffordd a phrawf Dunnett. Dangosir y gel a'r blot gwreiddiol yn Ffigur S1.
Mae camweithrediad mitocondriaidd yn gysylltiedig â chlefydau amlsystem yn amrywio o glefydau metabolaidd, cardiofasgwlaidd a chyhyrol i glefydau niwrolegol1,10. Mae llawer o glefydau niwroddirywiol a niwroddirywiol yn gysylltiedig â chamweithrediad mitocondriaidd, gan dynnu sylw at bwysigrwydd yr organynnau hyn drwy gydol oes yr ymennydd. Mae'r clefydau hyn yn cynnwys clefyd Parkinson, clefyd Alzheimer ac ASD3,4,18. Fodd bynnag, mae mynediad at feinwe'r ymennydd i astudio'r clefydau hyn yn anodd, yn enwedig ar y lefel fecanyddol, gan wneud systemau model cellog yn ddewis arall angenrheidiol. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn defnyddio system model cellog gan ddefnyddio celloedd SH-SY5Y wedi'u trin â PPA i ailadrodd y camweithrediad mitocondriaidd a welwyd mewn clefydau niwronau, yn enwedig anhwylderau sbectrwm awtistiaeth. Gall defnyddio'r model PPA hwn i astudio dynameg mitocondriaidd mewn niwronau roi cipolwg ar etioleg ASD.
Fe wnaethom archwilio'r posibilrwydd o ddefnyddio TEM i weld newidiadau mewn morffoleg mitocondriaidd. Mae'n bwysig nodi bod yn rhaid defnyddio TEM yn gywir i wneud y mwyaf o'i effeithiolrwydd. Mae paratoi cryo-sbesimenau yn caniatáu cadw strwythurau niwronaidd yn well trwy drwsio cydrannau cellog ar yr un pryd a lleihau ffurfio arteffactau34. Yn gyson â hyn, gwelsom fod gan gelloedd SH-SY5Y tebyg i niwronau organynnau isgellog cyfan a mitochondria hirgul (Ffig. 1a). Mae hyn yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb technegau paratoi cryogenig ar gyfer astudio morffoleg mitocondriaidd mewn modelau celloedd niwronaidd. Er bod mesuriadau meintiol yn hanfodol ar gyfer dadansoddi gwrthrychol data TEM, nid oes consensws o hyd ynghylch pa baramedrau penodol y dylid eu mesur i gadarnhau newidiadau morffolegol mitocondriaidd. Yn seiliedig ar nifer fawr o astudiaethau sydd wedi archwilio morffoleg mitocondriaidd yn feintiol17,31,32, fe wnaethom ddatblygu piblinell dadansoddi delweddau mitocondriaidd awtomataidd sy'n mesur wyth paramedr morffolegol, sef: arwynebedd, arwynebedd2, cymhareb agwedd, perimedr, cylchedd, gradd, diamedr Feret a chrwnedd.
Yn eu plith, lleihaodd PPA arwynebedd 2, arwynebedd, perimedr, a diamedr Feret yn sylweddol (Ffig. 1b–e). Dangosodd hyn fod mitochondria wedi dod yn llai ac yn fwy crwn, sy'n gyson ag astudiaethau blaenorol sy'n dangos gostyngiad yn arwynebedd mitocondriaidd ar ôl 72 awr o straen mitocondriaidd a achosir gan PPA30. Gall y nodweddion morffolegol hyn ddangos ymholltiad mitocondriaidd, proses angenrheidiol i atafaelu cydrannau sydd wedi'u difrodi o'r rhwydwaith mitocondriaidd i hyrwyddo eu diraddio trwy mitoffagiaeth35,36,37. Ar y llaw arall, gall y gostyngiad ym maint cyfartalog mitocondriaidd fod yn gysylltiedig â biogenesis cynyddol, sy'n arwain at ffurfio mitochondria bach newydd. Mae ymholltiad neu fiogenesis cynyddol yn cynrychioli ymateb iawndal i gynnal mitosis yn erbyn straen mitocondriaidd. Fodd bynnag, ni ellir diystyru twf mitocondriaidd is, uno amhariad, neu amodau eraill.
Er bod y delweddau cydraniad uchel a grëwyd gan TEM yn caniatáu pennu nodweddion morffolegol ar lefel mitochondria unigol, mae'r dull hwn yn cynhyrchu cipluniau dau ddimensiwn ar un adeg. I astudio ymatebion deinamig i straen metabolig, fe wnaethom staenio mitochondria gyda TMRE a defnyddio microsgopeg amser-dreigl gyda dadansoddiad MEL, sy'n caniatáu delweddu 3D trwybwn uchel o newidiadau yn y rhwydwaith mitocondriaidd dros amser33,38. Gwelsom newidiadau cynnil ond arwyddocaol mewn dynameg mitocondriaidd o dan straen PPA (Ffig. 2). Ar 3 mM, cynyddodd nifer y digwyddiadau ymholltiad yn sylweddol, tra bod digwyddiadau ymasiad yn aros yr un fath ag yn y rheolydd. Gwelwyd cynnydd yn nifer y digwyddiadau ymholltiad ac ymasiad ar 5 mM PPA, ond roedd y newidiadau hyn yn gymesur yn fras, gan awgrymu bod cineteg ymholltiad ac ymasiad yn cyrraedd cydbwysedd ar grynodiadau uwch (Ffig. 2b). Arhosodd y gyfaint mitocondriaidd cyfartalog yr un fath ar 3 a 5 mM PPA, gan ddangos bod cyfanrwydd y rhwydwaith mitocondriaidd wedi'i gadw (Ffig. 2d). Mae hyn yn adlewyrchu gallu rhwydweithiau mitocondriaidd deinamig i ymateb i straen metabolig ysgafn i gynnal homeostasis yn effeithiol heb achosi darnio rhwydwaith. Ar 3 mM PPA, mae'r cynnydd mewn ymholltiad yn ddigonol i hyrwyddo'r newid i gydbwysedd newydd, ond mae angen ailfodelu cinetig mwy dwys mewn ymateb i straen a achosir gan grynodiadau uwch o PPA.
Cynyddodd nifer y mitochondria ar y ddau grynodiad straen PPA, ond ni newidiodd cyfaint cyfartalog y mitochondria yn sylweddol (Ffig. 2c). Gall hyn fod oherwydd cynnydd mewn biogenesis neu gynnydd mewn rhannu; fodd bynnag, yn absenoldeb gostyngiad sylweddol yng nghyfaint cymedrig y mitochondria, mae'n fwy tebygol bod biosynthesis yn cynyddu. Fodd bynnag, mae'r data yn Ffigur 2 yn cefnogi bodolaeth dau fecanwaith digolledu: cynnydd yn nifer y digwyddiadau ymholltiad, sy'n gyson â chynyddu ymholltiad mitocondriaidd, a chynnydd yn nifer y digwyddiadau, sy'n gyson â biogenesis mitocondriaidd. Yn y pen draw, gall digolledu deinamig am straen ysgafn gynnwys prosesau ar yr un pryd sy'n cynnwys ymholltiad, uno, biogenesis, a mitoffagiaeth. Er bod awduron blaenorol wedi dangos bod PPA yn gwella mitosis30,39 a mitoffagiaeth29, rydym yn darparu tystiolaeth ar gyfer ailfodelu deinameg ymholltiad ac uno mitocondriaidd mewn ymateb i PPA. Mae'r data hyn yn cadarnhau'r newidiadau morffolegol a welwyd gan TEM ac yn rhoi cipolwg pellach ar y mecanweithiau sy'n gysylltiedig â chamweithrediad mitocondriaidd a achosir gan PPA.
Gan nad oedd dadansoddiad TEM na MEL wedi darparu tystiolaeth uniongyrchol o'r mecanweithiau rheoleiddio genynnau sy'n sail i'r newidiadau morffolegol a welwyd, fe wnaethom archwilio mynegiant RNA genynnau sy'n ymwneud â metaboledd, biogenesis a dynameg mitocondriaidd. Mae'r proto-oncogene cMYC yn ffactor trawsgrifio sy'n ymwneud â rheoleiddio mitochondria, glycolysis, metaboledd asid amino ac asid brasterog40. Yn ogystal, gwyddys bod cMYC yn rheoleiddio mynegiant bron i 600 o enynnau mitocondriaidd sy'n ymwneud â thrawsgrifio, cyfieithu a chydosod cymhleth mitocondriaidd, gan gynnwys NRF1 a TFAM41. Mae NRF1 a TFAM yn ddau reoleiddiwr canolog o mitosis, sy'n gweithredu i lawr yr afon o PGC-1α i actifadu atgynhyrchu mtDNA. Mae'r llwybr hwn yn cael ei actifadu gan signalau cAMP ac AMPK ac mae'n sensitif i wariant ynni a straen metabolaidd. Fe wnaethom hefyd archwilio NFE2L2, rheoleiddiwr redoks o fiogenesis mitocondriaidd, i benderfynu a allai effeithiau PPA gael eu cyfryngu gan straen ocsideiddiol.
Er bod mynegiant NFE2L2 wedi aros yr un fath, gwelsom ostyngiad cyson yn y mynegiant o cMYC, NRF1 a TFAM ar ôl 24 awr o driniaeth gyda 3 mM a 5 mM PPA (Ffig. 3a–c). Adroddwyd yn flaenorol bod gostyngiad mewn mynegiant cMYC yn ymateb i straen mitocondriaidd42, ac i'r gwrthwyneb, gall gostyngiad mewn mynegiant cMYC achosi camweithrediad mitocondriaidd trwy ailfodelu metaboledd mitocondriaidd, cysylltedd rhwydwaith, a pholareiddio pilen43. Yn ddiddorol, mae cMYC hefyd yn rhan o reoleiddio hollti a chyfuno mitocondriaidd42,43 ac mae'n hysbys ei fod yn cynyddu ffosfforyleiddiad DRP1 a lleoliad mitocondriaidd yn ystod rhaniad celloedd44, yn ogystal â chyfryngu ailfodelu morffolegol mitocondriaidd mewn celloedd bonyn niwronaidd45. Yn wir, mae ffibroblastau sy'n ddiffygiol o ran cMYC yn arddangos maint mitocondriaidd llai, yn gyson â newidiadau a achosir gan straen PPA43. Mae'r data hyn yn dangos perthynas ddiddorol ond aneglur eto rhwng cMYC a dynameg mitocondriaidd, gan ddarparu targed diddorol ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol o ailfodelu a achosir gan straen PPA.
Mae'r gostyngiad yn NRF1 a TFAM yn gyson â rôl cMYC fel actifadu trawsgrifio pwysig. Mae'r data hyn hefyd yn gyson ag astudiaethau blaenorol mewn celloedd canser y colon dynol sy'n dangos bod PPA wedi lleihau mynegiant mRNA NRF1 ar ôl 22 awr, a oedd yn gysylltiedig â disbyddu ATP a chynyddu ROS46. Adroddodd yr awduron hyn hefyd fod mynegiant TFAM wedi cynyddu ar ôl 8.5 awr ond dychwelodd i lefelau sylfaenol ar ôl 22 awr. Mewn cyferbyniad, dangosodd Kim et al. (2019) fod mynegiant mRNA TFAM wedi gostwng yn sylweddol ar ôl 4 awr o straen PPA mewn celloedd SH-SY5Y; fodd bynnag, ar ôl 72 awr, cynyddodd mynegiant protein TFAM yn sylweddol a chynyddodd nifer y copïau mtDNA yn sylweddol. Felly, nid yw'r gostyngiad yn nifer y genynnau biogenesis mitocondriaidd a welsom ar ôl 24 awr yn eithrio'r posibilrwydd bod y cynnydd yn nifer y mitocondria yn gysylltiedig ag actifadu biogenesis ar bwyntiau amser cynharach. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod PPA yn cynyddu mRNA a phrotein PGC-1α yn sylweddol mewn celloedd SH-SY5Y ar ôl 4 awr 30 munud, tra bod asid propionig yn gwella biogenesis mitocondriaidd mewn hepatocytau lloi trwy PGC-1α ar ôl 12 awr 39 munud. Yn ddiddorol, nid yn unig yw PGC-1α yn rheolydd trawsgrifio uniongyrchol o NRF1 a TFAM, ond dangoswyd hefyd ei fod yn rheoleiddio gweithgaredd MFN2 a DRP1 trwy reoleiddio hollti ac ymasiad47. Gyda'i gilydd, mae hyn yn tynnu sylw at y cyplu agos rhwng mecanweithiau sy'n rheoleiddio ymatebion digolledu mitocondriaidd a achosir gan PPA. Ar ben hynny, mae ein data yn adlewyrchu camreoleiddio sylweddol o reoleiddio trawsgrifio biogenesis a metaboledd o dan straen PPA.
Mae'r genynnau STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1 ymhlith y rheoleiddwyr canolog o ymholltiad, uno a deinameg mitocondriaidd37,48,49. Mae llawer o enynnau eraill sy'n ymwneud â deinameg mitocondriaidd, fodd bynnag, canfuwyd yn flaenorol bod STOML2, OPA1 ac MFN2 wedi'u methyleiddio'n wahanol mewn cohortau ASD,16 ac mae sawl astudiaeth annibynnol wedi nodi newidiadau yn y ffactorau trawsgrifio hyn mewn ymateb i straen mitocondriaidd50,51.52. Gostyngwyd mynegiant OPA1 a STOML2 yn sylweddol gan driniaeth PPA 3 mM a 5 mM (Ffig. 3e, f). Mae OPA1 yn un o'r rheoleiddwyr clasurol o uno mitocondriaidd trwy ryngweithio uniongyrchol ag MFN1 a 2 ac mae'n chwarae rhan mewn ailfodelu cristae a morffoleg mitocondriaidd53. Mae rôl union STOML2 mewn deinameg mitocondriaidd yn parhau i fod yn aneglur, ond mae tystiolaeth yn awgrymu ei fod yn chwarae rhan mewn uno mitocondriaidd, biogenesis, a mitoffagiaeth.
Mae STOML2 yn rhan o gynnal cyplu resbiradol mitocondriaidd a ffurfio cyfadeiladau cadwyn resbiradol54,55 ac mae wedi'i ddangos i newid nodweddion metabolaidd celloedd canser yn sylweddol56. Mae astudiaethau wedi dangos bod STOML2 yn hyrwyddo potensial pilen mitocondriaidd a biogenesis trwy ryngweithio â BAN a cardiolipin 55, 57, 58. Yn ogystal, mae astudiaethau annibynnol wedi dangos bod y rhyngweithio rhwng STOML2 a PINK1 yn rheoleiddio mitoffagiaeth59,60. Yn nodedig, adroddwyd bod STOML2 yn rhyngweithio'n uniongyrchol ag MFN2 ac yn ei sefydlogi ac mae hefyd yn chwarae rhan bwysig wrth sefydlogi isoformau OPA1 hir trwy atal y proteas sy'n gyfrifol am ddiraddio OPA153,61,62. Gall y gostyngiad yn mynegiant STOML2 a welwyd mewn adweithiau PPA wneud y proteinau cyfuno hyn yn fwy agored i ddiraddio trwy lwybrau sy'n ddibynnol ar iwbigwitin a phroteasom48. Er nad yw rôl fanwl gywir STOML2 ac OPA1 yn yr ymateb deinamig i PPA yn glir, gall mynegiant llai o'r genynnau ymasiad hyn (Ffigur 3) amharu ar y cydbwysedd rhwng hollti ac ymasiad ac arwain at faint mitocondriaidd llai (Ffigur 3). 1).
Ar y llaw arall, arhosodd mynegiant protein OPA1 yr un fath ar ôl 24 awr, tra na newidiodd lefelau mRNA a phrotein MFN1, MFN2 neu DRP1 yn sylweddol ar ôl triniaeth PPA (Ffig. 3g-i, Ffig. 4). Gall hyn ddangos nad oes unrhyw newidiadau yn rheoleiddio'r ffactorau hyn sy'n ymwneud ag ymasiad a hollti mitocondriaidd. Fodd bynnag, mae'n werth nodi bod pob un o'r pedwar genyn hyn hefyd yn cael ei reoleiddio gan addasiadau ôl-drawsgrifio (PTMs) sy'n rheoli gweithgaredd protein. Mae gan OPA1 wyth amrywiad sbleisio amgen sy'n cael eu hollti'n proteolytig mewn mitocondria i gynhyrchu dau isoform gwahanol 63 . Yn y pen draw, y cydbwysedd rhwng isoformau hir a byr sy'n pennu rôl OPA1 mewn ymasiad mitocondriaidd a chynnal a chadw'r rhwydwaith mitocondriaidd 64. Mae gweithgaredd DRP1 yn cael ei reoleiddio gan ffosfforyleiddiad protein kinase II sy'n ddibynnol ar galsiwm/calmodulin (CaMKII), tra bod diraddio DRP1 yn cael ei reoleiddio gan ubiquitineiddio a SUMOyleiddiad 65. Yn olaf, mae DRP1 ac MFN1/2 ill dau yn GTPasau, felly gall cyfradd cynhyrchu GTP mewn mitochondria ddylanwadu ar weithgaredd 66. Felly, er bod mynegiant y proteinau hyn yn aros yn gyson, efallai nad yw hyn yn adlewyrchu gweithgaredd protein neu leoliad heb ei newid 67,68. Yn wir, mae repertoires protein PTM presennol yn aml yn gwasanaethu fel y llinell amddiffyn gyntaf sy'n gyfrifol am gyfryngu ymatebion straen acíwt. Ym mhresenoldeb straen metabolig cymedrol yn ein model, mae'n debygol bod PTM yn hyrwyddo gweithgaredd cynyddol proteinau ymasiad a hollti i adfer cyfanrwydd mitocondriaidd yn ddigonol heb fod angen actifadu'r genynnau hyn ymhellach ar lefel yr mRNA neu'r protein.
Gyda'i gilydd, mae'r data uchod yn tynnu sylw at y rheoleiddio cymhleth ac amser-ddibynnol o forffoleg mitocondriaidd a'r heriau o egluro'r mecanweithiau hyn. I astudio mynegiant genynnau, mae'n angenrheidiol yn gyntaf nodi genynnau targed penodol yn y llwybr. Fodd bynnag, mae ein data yn dangos nad yw genynnau yn yr un llwybr yn ymateb yn yr un ffordd i'r un straen. Mewn gwirionedd, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall gwahanol enynnau yn yr un llwybr arddangos proffiliau ymateb amserol gwahanol30,46. Yn ogystal, mae mecanweithiau ôl-drawsgrifio cymhleth sy'n tarfu ar y berthynas rhwng trawsgrifio a swyddogaeth genynnau. Gall astudiaethau proteomig roi cipolwg ar effaith PTMs a swyddogaeth protein, ond maent hefyd yn peri heriau gan gynnwys dulliau trwybwn isel, cymhareb signal-i-sŵn uchel, a datrysiad gwael.
Yn y cyd-destun hwn, mae gan astudio morffoleg mitocondriaidd gan ddefnyddio TEM a MEL botensial mawr i fynd i'r afael â chwestiynau sylfaenol am y berthynas rhwng dynameg a swyddogaeth mitocondriaidd a sut mae hyn yn dylanwadu ar glefyd. Yn bwysicaf oll, mae TEM yn darparu dull uniongyrchol ar gyfer mesur morffoleg mitocondriaidd fel pwynt terfyn cydgyfeiriol o gamweithrediad a dynameg mitocondriaidd51. Mae MEL hefyd yn darparu dull uniongyrchol ar gyfer delweddu digwyddiadau ymhollti ac ymasiad mewn amgylchedd cellog tri dimensiwn, gan ganiatáu meintioli ailfodelu mitocondriaidd deinamig hyd yn oed yn absenoldeb newidiadau mewn mynegiant genynnau33. Yma rydym yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb technegau delweddu mitocondriaidd mewn clefydau mitocondriaidd eilaidd. Nodweddir y clefydau hyn fel arfer gan straen metabolaidd cronig ysgafn a nodweddir gan ailfodelu cynnil rhwydweithiau mitocondriaidd yn hytrach na difrod mitocondriaidd acíwt. Fodd bynnag, mae gan yr iawndal mitocondriaidd sy'n ofynnol i gynnal mitosis o dan straen cronig ganlyniadau swyddogaethol dwys. Yng nghyd-destun niwrowyddoniaeth, gall gwell dealltwriaeth o'r mecanweithiau iawndal hyn ddarparu gwybodaeth bwysig am y niwropatholeg pleiotropig sy'n gysylltiedig â chamweithrediad mitocondriaidd.
Yn y pen draw, mae ein data yn tynnu sylw at ddefnyddioldeb technegau delweddu ar gyfer deall canlyniadau swyddogaethol y rhyngweithiadau cymhleth rhwng mynegiant genynnau, addasiadau protein, a gweithgaredd protein sy'n rheoli dynameg mitocondriaidd niwronau. Defnyddiwyd PPA gennym i fodelu camweithrediad mitocondriaidd mewn model celloedd niwronau i gael cipolwg ar gydran mitocondriaidd ASD. Dangosodd celloedd SH-SY5Y a gafodd eu trin â PPA newidiadau mewn morffoleg mitocondriaidd: daeth mitochondria yn fach ac yn grwn, ac roedd cristae wedi'u diffinio'n wael pan welwyd hwy gan TEM. Mae dadansoddiad MEL yn dangos bod y newidiadau hyn yn digwydd ar yr un pryd â chynnydd mewn digwyddiadau ymhollti ac ymasiad i gynnal y rhwydwaith mitocondriaidd mewn ymateb i straen metabolaidd ysgafn. Ar ben hynny, mae PPA yn tarfu'n sylweddol ar reoleiddio trawsgrifio metaboledd mitocondriaidd a homeostasis. Nodwyd cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ac OPA1 fel rheoleiddwyr mitocondriaidd allweddol a darfir gan straen PPA a gallant chwarae rhan wrth gyfryngu newidiadau a achosir gan PPA mewn morffoleg a swyddogaeth mitocondriaidd. Mae angen astudiaethau yn y dyfodol i nodweddu newidiadau amserol a achosir gan PPA mewn mynegiant genynnau a gweithgaredd protein, lleoleiddio, ac addasiadau ôl-gyfieithu yn well. Mae ein data yn tynnu sylw at gymhlethdod a rhyngddibyniaeth y mecanweithiau rheoleiddio sy'n cyfryngu'r ymateb i straen mitocondriaidd ac yn dangos defnyddioldeb TEM a thechnegau delweddu eraill ar gyfer astudiaethau mecanistig mwy targedig.
Prynwyd y llinell gelloedd SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) gan Sigma-Aldrich. Tyfwyd celloedd SH-SY5Y mewn cymysgedd maetholion/F-12 cyfrwng wedi'i addasu gan Dulbecco's Eagle (DMEM/F-12) ac L-glwtamin (SC09411, ScienCell) mewn fflasgiau 25 cm2 wedi'u hategu â 20% serwm ffetws buchol (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ac 1% penisilin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ar 37 °C, 5% CO2. Is-ddiwylliwyd y celloedd i 80% o gydlifiad gan ddefnyddio 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), eu centrifugio ar 300 g a'u platio ar ddwysedd o tua 7 × 105 celloedd/ml. Perfformiwyd yr holl arbrawf ar gelloedd SH-SY5Y heb eu gwahaniaethu rhwng darnau 19–22. Gweinyddir PPA fel NaP. Toddwch bowdr NaP (Rhif CAS 137-40-6, fformiwla gemegol C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) mewn dŵr MilliQ cynnes i grynodiad o 1 M a'i storio ar 4 °C. Ar ddiwrnod y driniaeth, gwanhewch yr hydoddiant hwn gydag 1 M PPA i 3 mM a 5 mM PPA mewn cyfrwng di-serwm (DMEM/F-12 gydag L-glwtamin). Crynodiadau triniaeth ar gyfer yr holl arbrawf oedd dim PPA (0 mM, rheolaeth), 3 mM, a 5 mM PPA. Cynhaliwyd arbrofion mewn o leiaf dair dyblygiad biolegol.
Cafodd celloedd SH-SY5Y eu hau i fflasgiau 25 cm5 ar gyfradd o 5.5 × 105 celloedd/ml a'u tyfu am 24 awr. Ychwanegwyd y driniaeth PPA at y fflasg cyn 24 awr o ddeori. Casglwch belenni celloedd gan ddilyn protocolau isddiwylliant meinwe mamaliaid arferol (a ddisgrifir uchod). Ail-atalyddwch y belen celloedd mewn 100 µl o 2.5% glutaraldehyd, 1× PBS a'i storio ar 4 °C tan brosesu. Cafodd celloedd SH-SY5Y eu centrifugio'n fyr i belennu'r celloedd a chael gwared ar doddiant 2.5% glutaraldehyd, 1× PBS. Ail-atalyddwch y gwaddod mewn gel agaros 4% a baratowyd mewn dŵr distyll (cymhareb yr agaros i gyfaint y gwaddod yw 1:1). Gosodwyd darnau agaros ar gridiau ar blatiau gwastad a'u gorchuddio ag 1-hecsadecen cyn rhewi dan bwysedd uchel. Rhewwyd samplau mewn aseton 100% sych ar -90°C am 24 awr. Yna codwyd y tymheredd i -80°C ac ychwanegwyd toddiant o 1% osmiwm tetrocsid a 0.1% glutaraldehyd. Storiwyd samplau ar -80°C am 24 awr. Ar ôl hyn, cynyddwyd y tymheredd yn raddol i dymheredd ystafell dros sawl diwrnod: o – 80 °C i – 50 °C am 24 awr, i – 30 °C am 24 awr, i – 10 °C am 24 awr ac yn olaf i dymheredd ystafell.
Ar ôl paratoi cryogenig, cafodd y samplau eu trwytho â resin a gwnaed adrannau ultradenau (∼100 nm) gan ddefnyddio microtome ultra Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Cafodd yr adrannau eu staenio â 2% asetad wranyl a sitrad plwm. Arsylwyd y samplau gan ddefnyddio microsgop electron trosglwyddo FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (FEI gynt), Eindhoven, Yr Iseldiroedd) yn gweithredu ar 200 kV (trosglwyddydd Lab6) a chamera CCD Gatan (Gatan, DU) â hidlydd ynni Tridiem.
Ym mhob dyblygiad technegol, cafwyd o leiaf 24 o ddelweddau celloedd sengl, am gyfanswm o 266 o ddelweddau. Dadansoddwyd yr holl ddelweddau gan ddefnyddio'r macro Rhanbarth o Ddiddordeb (ROI) a'r macro Mitochondria. Mae'r macro mitocondriaidd yn seiliedig ar ddulliau cyhoeddedig17,31,32 ac mae'n caniatáu prosesu swp lled-awtomataidd o ddelweddau TEM yn Fiji/ImageJ69. Yn gryno: mae'r ddelwedd yn cael ei gwrthdroi a'i gwrthdroi gan ddefnyddio tynnu cefndir pêl rolio (radiws 60 picsel) a hidlydd bandpas FFT (gan ddefnyddio ffiniau uchaf ac isaf 60 ac 8 picsel yn y drefn honno) ac atal llinell fertigol gyda goddefgarwch cyfeiriadedd o 5%. Caiff y ddelwedd wedi'i phrosesu ei throthwyo'n awtomatig gan ddefnyddio algorithm entropi uchaf a chynhyrchir mwgwd deuaidd. Cafodd rhanbarthau delwedd sy'n gysylltiedig ag ROIs a ddewiswyd â llaw mewn delweddau TEM crai eu tynnu, gan nodweddu mitochondria ac eithrio'r bilen plasma a rhanbarthau cyferbyniad uchel eraill. Ar gyfer pob ROI a echdynnwyd, dadansoddwyd gronynnau deuaidd yn fwy na 600 picsel, a mesurwyd arwynebedd gronynnau, perimedr, echelinau mawr a bach, diamedr Feret, crwnder, a chylchred gan ddefnyddio swyddogaethau mesur adeiledig Fiji/ImageJ. Yn dilyn Merrill, Flippo, a Strack (2017), cyfrifwyd arwynebedd 2, cymhareb agwedd gronynnau (cymhareb echelin fawr i echelin fach), a ffactor siâp (FF) o'r data hyn, lle mae FF = perimedr 2/4pi x arwynebedd. Gellir dod o hyd i ddiffiniad y fformiwla baramedrig yn Merrill, Flippo, a Strack (2017). Mae'r macros a grybwyllir ar gael ar GitHub (gweler y Datganiad Argaeledd Data). Ar gyfartaledd, dadansoddwyd tua 5,600 o ronynnau fesul triniaeth PPA, am gyfanswm o tua 17,000 o ronynnau (data heb ei ddangos).
Gosodwyd celloedd SH-SH5Y mewn dysglau diwylliant 8 siambr (ThermoFisher, #155411) i ganiatáu adlyniad dros nos ac yna eu deori gyda TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) a Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). lliwio. Cafwyd delweddau gan ddefnyddio laserau 405 nm a 561 nm dros amgylchedd 10 munud, a chafwyd delweddau crai fel pentyrrau-z yn cynnwys 10 micrograff delwedd gyda cham az o 0.2 μm rhwng fframiau delwedd ar 12 pwynt amser olynol. Casglwyd delweddau gan ddefnyddio platfform uwch-ddatrysiad Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, yr Almaen) gan ddefnyddio lens LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Dadansoddwyd delweddau yn ImageJ gan ddefnyddio piblinell a ddisgrifiwyd yn flaenorol a'r ategyn ImageJ i fesur digwyddiadau cyfuno a hollti, nifer cyfartalog strwythurau mitocondriaidd, a chyfaint mitocondriaidd cyfartalog fesul cell33. Mae macros MEL ar gael ar GitHub (gweler y Datganiad Argaeledd Data).
Tyfwyd celloedd SH-SY5Y mewn platiau chwe ffynnon ar ddwysedd o 0.3 × 106 celloedd/mL am 24 awr cyn y driniaeth. Echdynnwyd RNA gan ddefnyddio'r protocol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) gyda mân addasiadau: ychwanegwch 300 μl o glustog lysis RNA at bob ffynnon cyn ei dynnu a lysiswch bob sampl fel cam olaf gyda 30 μl o ddŵr heb elusiwn DNase/RNase. Gwiriwyd pob sampl am faint ac ansawdd gan ddefnyddio Spectroffotomedr UV-Vis NanoDrop ND-1000. Cafwyd cyfanswm y protein o lysadau celloedd gan ddefnyddio 200 μl o glustog lysis RIPA, a meintioliwyd crynodiad y protein gan ddefnyddio assay protein Bradford70.
Perfformiwyd synthesis cDNA gan ddefnyddio'r Pecyn Synthesis cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr gyda rhai addasiadau. Syntheseiddiwyd cDNA mewn adweithiau 20-μl gan ddefnyddio 0.7 i 1 μg o gyfanswm RNA. Dewiswyd primerau o bapurau a gyhoeddwyd yn flaenorol 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabl S1) a chynlluniwyd y chwiliedyddion cysylltiedig gan ddefnyddio'r offeryn PrimerQuest gan Integrated DNA Technologies. Normaleiddiwyd yr holl enynnau o ddiddordeb i'r genyn niwclear B2M. Mesurwyd mynegiant genyn STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ac OPA1 gan RT-qPCR. Roedd y cymysgedd meistr yn cynnwys polymerase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM o brimerau ymlaen ac yn ôl, cDNA, a dŵr gradd PCR i gynhyrchu cyfaint terfynol o 10 μL ar gyfer pob adwaith. Mesurwyd mynegiant genynnau rhannu a hollti (DRP1, MFN1/2) gan ddefnyddio assayau amlblecs TaqMan. Defnyddiwyd Cymysgedd Meistr Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr gyda mân addasiadau. Mae'r cymysgedd meistr amlblecs RT-qPCR yn cynnwys polymerase LUNA Taq 1X, primerau ymlaen ac yn ôl 10 μM, 10 μM o brob, cDNA, a dŵr gradd PCR, gan arwain at gyfaint terfynol o 20 μL ar gyfer pob adwaith. Perfformiwyd RT-qPCR gan ddefnyddio Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—rhif cyfresol: R0618110). Dangosir yr amodau beicio yn Nhabl S1. Cafodd pob sampl cDNA ei fwyhau mewn triphlyg a chynhyrchwyd cromlin safonol gan ddefnyddio cyfres o wanhadau degplyg. Tynnwyd allanolion mewn samplau triphlyg gyda gwyriad safonol trothwy cylchred (Ct) >0.5 o'r dadansoddiad i sicrhau atgynhyrchadwyedd data30,72. Cyfrifwyd mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio'r dull 2-ΔΔCt79.
Cymysgwyd samplau protein (60 μg) â byffer llwytho Laemmli ar gymhareb o 2:1 a'u rhedeg ar gel protein di-liw 12% (Bio-Rad #1610184). Trosglwyddwyd proteinau i bilen PVDF (polyfinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) gan ddefnyddio'r system Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Cafodd y bilen ei rhwystro a'i magu gyda'r gwrthgyrff cynradd priodol (OPA1, MFN1, MFN2, a DRP1) (wedi'u gwanhau 1:1000) am 48 awr, ac yna ei magu gydag gwrthgyrff eilaidd (1:10,000) am 1 awr. Yna delweddwyd y pilenni gan ddefnyddio Swbstrad Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) a'u cofnodi gan ddefnyddio system Bio-Rad ChemiDoc MP. Defnyddiwyd ImageLab fersiwn 6.1 ar gyfer dadansoddiad Western blot. Dangosir y gel a'r blot gwreiddiol yn Ffigur S1. Darperir gwybodaeth am wrthgyrff yn Nhabl S2.
Cyflwynir setiau data fel y cymedr a'r gwall safonol o'r cymedr (SEM) o leiaf dair sampl annibynnol. Profwyd setiau data am normalrwydd gan ddefnyddio prawf Shapiro-Wilks (oni nodir yn wahanol) cyn tybio dosraniad Gaussaidd a gwyriadau safonol cyfartal a bwrw ymlaen â'r dadansoddiadau. Yn ogystal â dadansoddi'r set ddata gan ddefnyddio MEL LSD Fisher (p < 0.05), ANOVA unffordd (cymedr triniaeth vs. rheoli), a phrawf cymhariaeth lluosog Dunnett i bennu arwyddocâd (p < 0.05). Dangosir gwerthoedd p arwyddocaol yn y graff fel *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Perfformiwyd a chynhyrchwyd yr holl ddadansoddiadau a graffiau ystadegol gan ddefnyddio GraphPad Prism 9.4.0.
Mae macros Fiji/ImageJ ar gyfer dadansoddi delweddau TEM ar gael yn gyhoeddus ar GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mae'r macro Mitochondrial Event Locator (MEL) ar gael yn gyhoeddus ar GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM a Vijaya A. Mitochondria: rheoleiddwyr meistr metaboledd, homeostasis, straen, heneiddio ac epigeneteg. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Camweithrediad mitocondriaidd amlochrog mewn sgitsoffrenia, cymhleth I fel targed patholegol posibl. Sgitsoffrenia. adnodd. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. a Beal, MF Camweithrediad mitochondrial mewn clefyd Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG a Mehta V. Mitochondria dan straen: targedau goresgyniad mewn clefyd Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF a Ferreira GK Mitochondria a'r ymennydd: bio-ynergeteg a mwy. Niwrotocsinau. adnodd. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitochondria pleiotropig: effaith mitochondria ar ddatblygiad a chlefyd niwronau. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. a Morais, VA Biogenesis mitochondrial mewn niwronau: sut a ble. rhyngwladoldeb. J. Mohr. y wyddoniaeth. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. a Zhao, J. Rheoleiddio dynameg mitocondriaidd mamaliaid: cyfleoedd a heriau. blaen. endocrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. a Slack, RS Dynameg mitochondrial wrth reoleiddio niwrogenesis: o'r ymennydd sy'n datblygu i'r ymennydd sy'n oedolyn. datblygiad. dynamic. 247, 47–53 (2018).