Presennol *Cyfeiriad presennol: Cologne 50931, Yr Almaen, Clwstwr Rhagoriaeth Cologne Ymchwil ar Ymateb i Straen Cellog mewn Clefydau sy'n gysylltiedig â Heneiddio (CECAD).
Ystyrir bod niwroddirywiad clefydau mitocondriaidd yn anghildroadwy oherwydd bod plastigedd metabolaidd niwronau yn gyfyngedig, ond nid yw effaith camweithrediad mitocondriaidd ar ymreolaeth celloedd metaboledd niwronau yn y corff wedi'i ddeall yn dda. Yma, rydym yn cyflwyno proteome penodol i gelloedd niwronau Purkinje â diffyg OXPHOS cynyddol a achosir gan ddeinameg ymasiad mitocondriaidd wedi'i tharfu. Gwelsom fod camweithrediad mitocondriaidd wedi sbarduno newid dwys ym maes proteomeg, a arweiniodd yn y pen draw at actifadu dilyniannol rhaglenni metabolaidd manwl gywir cyn marwolaeth celloedd. Yn annisgwyl, penderfynom ar y broses o ysgogi pyruvate carboxylase (PCx) ac ensymau gwrth-heneiddio eraill sy'n ategu canolradd y cylch TCA. Gwaethygodd atal PCx straen ocsideiddiol a niwroddirywiad, gan ddangos bod gan atherosglerosis effaith amddiffynnol mewn niwronau sydd heb OXPHOS. Mae adfer ymasiad mitocondriaidd mewn niwronau sydd wedi dirywio'n derfynol yn gwrthdroi'r nodweddion metabolaidd hyn yn llwyr, a thrwy hynny'n atal marwolaeth celloedd. Mae ein canfyddiadau'n nodi llwybrau anhysbys o'r blaen sy'n rhoi gwydnwch i gamweithrediad mitocondriaidd ac yn dangos y gellir gwrthdroi niwroddirywiad hyd yn oed yng nghyfnodau hwyr y clefyd.
Mae rôl ganolog mitochondria wrth gynnal metaboledd ynni niwronaidd yn cael ei phwysleisio gan y symptomau niwrolegol helaeth sy'n gysylltiedig â chlefydau mitocondriaidd dynol. Mae'r rhan fwyaf o'r clefydau hyn yn cael eu hachosi gan dreigladau genynnau sy'n rheoleiddio mynegiant genynnau mitocondriaidd (1, 2) neu ddinistrio genynnau sy'n gysylltiedig â dynameg mitocondriaidd, sy'n effeithio'n anuniongyrchol ar sefydlogrwydd DNA mitocondriaidd (mtDNA) (3, 4). Mae gwaith mewn modelau anifeiliaid wedi dangos, mewn ymateb i gamweithrediad mitocondriaidd mewn meinweoedd cyfagos, y gellir actifadu llwybrau metabolaidd ceidwadol (5-7), sy'n darparu gwybodaeth bwysig ar gyfer dealltwriaeth fanwl o bathogenesis y clefydau cymhleth hyn. Mewn cyferbyniad llwyr, mae ein dealltwriaeth o'r newidiadau metabolaidd mewn mathau penodol o gelloedd a achosir gan fethiant cyffredinol cynhyrchu adenosin triffosffad (ATP) mitocondriaidd yr ymennydd yn sylfaenol (8), gan bwysleisio'r angen i nodi targedau therapiwtig y gellir eu defnyddio i atal neu atal clefydau. Atal niwroddirywiad (9). Y diffyg gwybodaeth yw'r ffaith bod celloedd nerf yn cael eu hystyried yn eang fel rhai sydd â hyblygrwydd metabolaidd cyfyngedig iawn o'i gymharu â mathau celloedd meinweoedd cyfagos (10). O ystyried bod y celloedd hyn yn chwarae rhan ganolog wrth gydlynu cyflenwad metabolion i niwronau i hyrwyddo trosglwyddiad synaptig ac ymateb i anafiadau a chyflyrau clefydau, mae'r gallu i addasu metaboledd celloedd i amodau heriol meinwe'r ymennydd bron yn gyfyngedig i gelloedd glial (11-14). Yn ogystal, mae amrywioldeb cellog cynhenid ​​meinwe'r ymennydd yn llesteirio astudiaeth o newidiadau metabolaidd sy'n digwydd mewn is-grwpiau niwronau penodol i raddau helaeth. O ganlyniad, ychydig a wyddys am union ganlyniadau cellog a metabolaidd camweithrediad mitocondriaidd mewn niwronau.
Er mwyn deall canlyniadau metabolaidd camweithrediad mitocondriaidd, fe wnaethom ynysu niwronau Purkinje (PNs) mewn gwahanol gamau o niwroddirywiad a achosir gan ddinistrio ymasiad pilen allanol mitocondriaidd (Mfn2). Er bod mwtaniadau Mfn2 mewn bodau dynol yn gysylltiedig â math o niwropathi synhwyraidd echddygol etifeddol a elwir yn Charcot-Marie-Tooth math 2A (15), mae dinistrio amodol Mfn2 mewn llygod yn ddull cydnabyddedig o ysgogi camweithrediad ocsideiddio Ffosfforyleiddiad (OXPHOS). Mae'r gwahanol isdeipiau niwronaidd (16-19) a'r ffenoteip niwroddirywiol sy'n deillio o hyn yn cyd-fynd â symptomau niwrolegol cynyddol, megis anhwylderau symud (18, 19) neu ataxia serebelar (16). Trwy ddefnyddio cyfuniad o broteomeg meintiol di-label (LFQ), metabolomeg, delweddu, a dulliau firolegol, rydym yn dangos bod niwroddirywiad cynyddol yn ysgogi carboxylase pyruvate (PCx) a ffactorau eraill sy'n ymwneud ag arteriosclerosis PNs in vivo yn gryf. Mynegiant ensymau. I wirio perthnasedd y canfyddiad hwn, fe wnaethom leihau mynegiant PCx mewn niwroddirywiad celloedd sy'n ddiffygiol o ran Mfn2 yn benodol, a chanfod bod y llawdriniaeth hon yn gwaethygu straen ocsideiddiol ac yn cyflymu niwroddirywiad, gan brofi felly bod asoospermia yn rhoi addasrwydd metabolaidd i farwolaeth celloedd. Gall mynegiant difrifol o MFN2 achub y niwroddirywiad celloedd sy'n achosi dirywiad terfynol yn llwyr gyda diffyg OXPHOS difrifol, defnydd enfawr o DNA mitocondriaidd, a rhwydwaith mitocondriaidd sydd wedi torri i bob golwg, sy'n pwysleisio ymhellach y gall y math hwn o niwroddirywiad hyd yn oed wella yng nghyfnod datblygedig y clefyd cyn marwolaeth celloedd.
Er mwyn delweddu'r mitochondria mewn PNs knockout Mfn2, fe wnaethom ddefnyddio straen llygoden sy'n caniatáu i mitochondria sy'n ddibynnol ar Cre dargedu mynegiant Cre protein fflwroleuol melyn (YFP) (mtYFP) (20) a gwirio'r morffoleg mitocondriaidd in vivo. Fe wnaethom ganfod y byddai dinistrio'r genyn Mfn2 mewn PNs yn arwain at rannu'r rhwydwaith mitocondriaidd yn raddol (Ffigur S1A), a chanfuwyd y newid cynharaf yn 3 wythnos oed. Mewn cyferbyniad, ni ddechreuodd dirywiad sylweddol haen celloedd PN, fel y dangosir gan golli imiwnostainio Calbindin, tan 12 wythnos oed (Ffigur 1, A a B). Fe wnaeth y gwahaniaeth amser rhwng y newidiadau cynharaf mewn morffoleg mitocondriaidd a dechrau gweladwy marwolaeth niwronaidd ein hannog i ymchwilio i'r newidiadau metabolaidd a sbardunwyd gan gamweithrediad mitocondriaidd cyn marwolaeth celloedd. Fe wnaethom ddatblygu strategaeth yn seiliedig ar ddidoli celloedd wedi'u actifadu gan fflwroleuedd (FACS) i ynysu PN sy'n mynegi YFP (YFP+) (Ffigur 1C), ac mewn llygod rheoli (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), y cyfeirir atynt o hyn ymlaen fel CTRL (Ffigur S1B). Mae optimeiddio'r strategaeth giatio yn seiliedig ar ddwyster cymharol y signal YFP yn caniatáu inni buro corff YFP+ (YFPhigh) o PNs o rai nad ydynt yn PNs (YFPneg) (Ffigur S1B) neu ddarnau axon/dendritig fflwroleuol tybiedig (YFPlow; Ffigur S1D, chwith), a gadarnhawyd gan ficrosgop confocal (Ffigur S1D, dde). Er mwyn gwirio hunaniaeth y boblogaeth ddosbarthedig, fe wnaethom gynnal proteomeg LFQ ac yna dadansoddiad cydrannau prif, a chanfod bod gwahaniad clir rhwng celloedd YFPhigh ac YFPneg (Ffigur S1C). Dangosodd celloedd YFPhigh gyfoethogiad net o farcwyr PNs hysbys (h.y. Calb1, Pcp2, Grid2 ac Itpr3) (21, 22), ond dim cyfoethogiad o broteinau a fynegir yn gyffredin mewn niwronau neu fathau eraill o gelloedd (Ffigur 1D)). Dangosodd cymhariaeth rhwng samplau mewn celloedd YFPhigh dosbarthedig a gasglwyd mewn arbrofion annibynnol gyfernod cydberthynas > 0.9, gan ddangos atgynhyrchadwyedd da rhwng dyblygiadau biolegol (Ffigur S1E). I grynhoi, dilysodd y data hyn ein cynllun ar gyfer ynysu PN ymarferol acíwt a phenodol. Gan fod y system gyrrwr L7-cre a ddefnyddiwyd yn ysgogi ailgyfuno mosaig yn yr wythnos gyntaf ar ôl ei esgor (23), dechreuon ni ddifa llygod o CTRL a chasglu niwronau amodol (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Ar ôl cwblhau'r ailgyfuno, fe'i gelwir yn Mfn2cKO yn 4 wythnos oed. Fel y pwynt terfyn, fe ddewison ni 8 wythnos oed pan oedd yr haen PN yn gyfan er gwaethaf y darniad mitocondriaidd amlwg (Ffigur 1B a Ffigur S1A). At ei gilydd, fe wnaethon ni fesur cyfanswm o 3013 o broteinau, ac roedd tua 22% ohonynt yn seiliedig ar anodiadau MitoCarta 2.0 yn seiliedig ar y proteom mitocondriaidd fel mitochondria (Ffigur 1E) (Ffigur 1E) (24). Dangosodd y dadansoddiad mynegiant genynnau gwahaniaethol a gynhaliwyd yn wythnos 8 mai dim ond 10.5% o'r holl broteinau oedd â newidiadau sylweddol (Ffigur 1F a Ffigur S1F), ac roedd 195 o broteinau wedi'u gostwng a 120 o broteinau wedi'u huwchreoleiddio (Ffigur 1F). Mae'n werth nodi bod y "dadansoddiad llwybr arloesol" o'r set ddata hon yn dangos bod y genynnau a fynegir yn wahaniaethol yn perthyn yn bennaf i set gyfyngedig o lwybrau metabolaidd penodol (Ffigur 1G). Yn ddiddorol, er bod y gostyngiad mewn llwybrau sy'n gysylltiedig ag OXPHOS a signalau calsiwm yn cadarnhau'r broses o ysgogi camweithrediad mitocondriaidd mewn PNs diffygiol o ran cyfuno, mae categorïau eraill sy'n ymwneud yn bennaf â metaboledd asidau amino wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol, sy'n unol â'r metaboledd sy'n digwydd mewn PNs mitocondriaidd. Mae ailweirio yn gyson.
(A) Ffotograffau confocal cynrychioliadol o adrannau serebelar llygod CTRL ac Mfn2cKO yn dangos colled raddol o niwronau niwronau (calbindin, llwyd); gwrth-liwiwyd y niwclysau â DAPI. (B) Mesur (A) (dadansoddiad unffordd o amrywiant, ***P<0.001; n = 4 i 6 cylch o dair llygoden). (C) Llif gwaith arbrofol. (D) Dosbarthiad map gwres o farcwyr penodol i Purkinje (top) a mathau eraill o gelloedd (canol). (E) Diagram Venn yn dangos nifer y proteinau mitocondriaidd a nodwyd yn y niwronau niwronau dosbarthedig. (F) Plot llosgfynydd o broteinau a fynegir yn wahanol mewn niwronau Mfn2cKO ar ôl 8 wythnos (gwerth torri arwyddocâd o 1.3). (G) Mae'r dadansoddiad llwybr creadigrwydd yn dangos y pum llwybr rheoleiddio i fyny (coch) a rheoleiddio i lawr (glas) pwysicaf yn y niwronau niwronau niwronau Mfn2cKO a ddosbarthwyd fel 8 wythnos. Dangosir lefel mynegiant cyfartalog pob protein a ganfuwyd. Map gwres graddfa lwyd: gwerth P wedi'i addasu. ns, ddim yn bwysig.
Dangosodd data proteomeg fod mynegiant protein cymhlygion I, III, ac IV wedi gostwng yn raddol. Roedd cymhlygion I, III, ac IV i gyd yn cynnwys is-unedau hanfodol wedi'u hamgodio gan mtDNA, tra nad oedd cymhlyg II, a oedd ond wedi'i godio gan y niwclear, wedi'i effeithio i raddau helaeth (Ffigur 2A a Ffigur S2A). . Yn gyson â chanlyniadau'r proteomeg, dangosodd imiwnohistochemeg adrannau meinwe serebelar fod lefel is-uned MTCO1 (is-uned 1 ocsidas cytochrome C mitochondrial) cymhlyg IV mewn PN wedi gostwng yn raddol (Ffigur 2B). Gostyngwyd yr is-uned Mtatp8 wedi'i hamgodio gan mtDNA yn sylweddol (Ffigur S2A), tra arhosodd lefel cyflwr cyson yr is-uned synthase ATP wedi'i hamgodio gan y niwclear yr un fath, sy'n gyson â'r cymhlyg is-gynulliad synthase ATP sefydlog hysbys F1 pan fo mynegiant mtDNA yn sefydlog. Mae'r ffurfiant yn gyson. Torri ar draws (7). Cadarnhaodd gwerthusiad o lefel y mtDNA yn y PNs Mfn2cKO wedi'u didoli trwy adwaith cadwyn polymerase amser real (qPCR) y gostyngiad graddol yn nifer y copïau mtDNA. O'i gymharu â'r grŵp rheoli, ar 8 wythnos oed, dim ond tua 20% o lefel y mtDNA a gadwyd (Ffigur 2C). Yn gyson â'r canlyniadau hyn, defnyddiwyd staenio microsgop confocal o PNs Mfn2cKO i ganfod DNA, gan ddangos y defnydd o niwcleotidau mitocondriaidd sy'n ddibynnol ar amser (Ffigur 2D). Gwelsom mai dim ond rhai ymgeiswyr sy'n ymwneud â diraddio protein mitocondriaidd ac ymateb i straen a gafodd eu huchreoleiddio, gan gynnwys Lonp1, Afg3l2 a Clpx, a ffactorau cydosod cymhleth OXPHOS. Ni chanfuwyd unrhyw newidiadau sylweddol yn lefelau'r proteinau sy'n ymwneud ag apoptosis (Ffigur S2B). Yn yr un modd, gwelsom mai dim ond mân newidiadau sydd gan y sianeli mitochondria a'r reticwlwm endoplasmig sy'n ymwneud â chludo calsiwm (Ffigur S2C). Yn ogystal, ni chanfuwyd unrhyw newidiadau sylweddol wrth werthuso proteinau sy'n gysylltiedig ag awtoffagogi, sy'n gyson â'r ymsefydlu gweladwy o awtoffagosomau a welwyd in vivo gan imiwnohistocemeg a microsgopeg electron (Ffigur S3). Fodd bynnag, mae'r camweithrediad OXPHOS cynyddol mewn PNs yn cyd-fynd â newidiadau mitocondriaidd uwchstrwythurol amlwg. Gellir gweld clystyrau mitocondriaidd yng nghorffau celloedd a choed dendritig PNs Mfn2cKO 5 ac 8 wythnos oed, ac mae strwythur y bilen fewnol wedi cael newidiadau dwys (Ffigur S4, A a B). Yn gyson â'r newidiadau uwchstrwythurol hyn a gostyngiad sylweddol mewn mtDNA, dangosodd dadansoddiad o sleisys serebelar yr ymennydd acíwt gydag ester methyl tetramethylrhodamine (TMRM) fod potensial y bilen mitocondriaidd mewn PNs Mfn2cKO wedi gostwng yn sylweddol (Ffigur S4C).
(A) Dadansoddiad cwrs amser o lefel mynegiant cymhlyg OXPHOS. Ystyriwch broteinau â P<0.05 ar ôl 8 wythnos yn unig (ANOVA dwy ffordd). Llinell ddotiog: Dim addasiad o'i gymharu â CTRL. (B) Chwith: Enghraifft o adran serebelar wedi'i labelu ag gwrthgorff gwrth-MTCO1 (bar graddfa, 20 μm). Mae'r ardal a feddiannir gan gyrff celloedd Purkinje wedi'i gorchuddio â melyn. Dde: Mesur lefelau MTCO1 (dadansoddiad unffordd o amrywiant; n = 7 i 20 celloedd wedi'u dadansoddi o dair llygoden). (C) Dadansoddiad qPCR o nifer copi mtDNA yn y PN wedi'i ddidoli (dadansoddiad unffordd o amrywiant; n = 3 i 7 llygoden). (D) Chwith: Enghraifft o sleisen serebelar wedi'i labelu ag gwrthgorff gwrth-DNA (bar graddfa, 20 μm). Mae'r ardal a feddiannir gan gyrff celloedd Purkinje wedi'i gorchuddio â melyn. Dde: Mesur briwiau mtDNA (dadansoddiad unffordd o amrywiant; n = 5 i 9 celloedd o dair llygoden). (E) Enghraifft o adran serebelar acíwt yn dangos celloedd mitoYFP + Purkinje (saeth) mewn recordiad clamp clwt cell gyfan. (F) Mesur cromlin IV. (G) Recordiadau cynrychioliadol o chwistrelliad cerrynt dadbolaru mewn celloedd Purkinje CTRL ac Mfn2cKO. Olrhain uchaf: Y pwls cyntaf a sbardunodd AP. Olrhain gwaelod: Amlder AP uchaf. (H) Mesur mewnbynnau digymell ôl-synaptig (sPSPs). Dangosir yr olin recordio cynrychioliadol a'i gymhareb chwyddo yn (I). Dadansoddwyd dadansoddiad amrywiant unffordd n = 5 i 20 cell o dair llygoden. Mynegir data fel cymedr ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Olrhain cynrychioliadol o AP digymell a gofnodwyd gan ddefnyddio'r modd clamp clwt tyllog. Olrhain uchaf: Amlder AP uchaf. Olrhain gwaelod: chwyddo un AP. (K) Mesurwch amlder AP cyfartalog ac uchaf yn ôl (J). Prawf Mann-Whitney; dadansoddwyd n = 5 cell o bedwar llygoden. Mynegir data fel cymedr ± SEM; nid yw'n bwysig.
Canfuwyd difrod amlwg i OXPHOS yn y PN Mfn2cKO 8 wythnos oed, sy'n dangos bod swyddogaeth ffisiolegol niwronau yn annormal iawn. Felly, dadansoddom nodweddion trydanol goddefol niwronau diffygiol o ran OXPHOS ar 4 i 5 wythnos a 7 i 8 wythnos trwy gynnal recordiadau clampio clytiau celloedd cyfan mewn sleisys serebelar acíwt (Ffigur 2E). Yn annisgwyl, roedd potensial pilen gorffwys cyfartalog a gwrthiant mewnbwn niwronau Mfn2cKO yn debyg i'r rheolydd, er bod gwahaniaethau cynnil rhwng celloedd (Tabl 1). Yn yr un modd, ar 4 i 5 wythnos oed, ni chanfuwyd unrhyw newidiadau sylweddol yn y berthynas cerrynt-foltedd (cromlin IV) (Ffigur 2F). Fodd bynnag, ni oroesodd unrhyw niwronau Mfn2cKO 7 i 8 wythnos oed y regimen IV (cam hyperbolareiddio), sy'n dangos bod sensitifrwydd clir i botensial hyperbolareiddio yn y cam hwyr hwn. Mewn cyferbyniad, mewn niwronau Mfn2cKO, mae'r ceryntau dadbolaru sy'n achosi gollyngiadau potensial gweithredu ailadroddus (AP) yn cael eu goddef yn dda, sy'n dangos nad yw eu patrymau rhyddhau cyffredinol yn sylweddol wahanol i rai niwronau rheoli 8 wythnos oed (Tabl 1 a Ffigur 2G). Yn yr un modd, roedd amlder ac osgled ceryntau ôl-synaptig digymell (sPSCs) yn gymharol â rhai'r grŵp rheoli, a chynyddodd amlder digwyddiadau o 4 wythnos i 5 wythnos i 7 wythnos i 8 wythnos gyda chynnydd tebyg (Ffigur 2, H ac I). Cyfnod aeddfedu synaptig mewn PNs (25). Cafwyd canlyniadau tebyg ar ôl clytiau PNs tyllog. Mae'r cyfluniad hwn yn atal y posibilrwydd o ddigolledu diffygion ATP cellog, fel y gallai ddigwydd mewn cofnodi clamp clytiau celloedd cyfan. Yn benodol, ni effeithiwyd ar botensial pilen gorffwys ac amlder tanio digymell niwronau Mfn2cKO (Ffigur 2, J a K). I grynhoi, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall PNs â chamweithrediad OXPHOS amlwg ymdopi â phatrymau rhyddhau amledd uchel yn dda, gan ddangos bod mecanwaith iawndal sy'n caniatáu iddynt gynnal ymatebion electroffisiolegol bron yn normal.
Mynegir data fel cymedr ± SEM (dadansoddiad amrywiant unffordd, prawf cymhariaeth lluosog Holm-Sidak; *P<0.05). Nodir rhif yr uned gan gromfachau.
Fe wnaethon ni geisio ymchwilio i weld a oedd unrhyw gategori yn y set ddata proteomeg (Ffigur 1G) yn cynnwys llwybrau a all wrthweithio diffyg OXPHOS difrifol, a thrwy hynny egluro pam y gall niwro-niferos yr effeithir arnynt gynnal electroffisioleg bron yn normal (Ffigur 2, E i K). Dangosodd dadansoddiad proteomeg fod yr ensymau sy'n ymwneud â chataboliaeth asidau amino cadwyn ganghennog (BCAA) wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol (Ffigur 3A a Ffigur S5A), a gall y cynnyrch terfynol asetyl-CoA (CoA) neu succinyl CoA ategu'r tricarboxyladau mewn cylchred Asid arteriosclerosis (TCA). Fe wnaethon ni ganfod bod cynnwys transaminase 1 BCAA (BCAT1) a BCAT2 ill dau wedi cynyddu. Maent yn cataleiddio cam cyntaf cataboliaeth BCAA trwy gynhyrchu glwtamad o α-ketoglutarate (26). Mae pob is-uned sy'n ffurfio'r cyfadeilad ceto asid dehydrogenase cadwyn ganghennog (BCKD) wedi'i uwchreoleiddio (mae'r cyfadeilad yn cataleiddio'r dadgarboxyleiddio dilynol ac anadferadwy o'r sgerbwd carbon BCAA sy'n deillio o hyn) (Ffigur 3A a Ffigur S5A). Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw newidiadau amlwg yn y BCAA ei hun yn y PN wedi'i ddidoli, a allai fod oherwydd y cynnydd mewn cymeriant cellog yr asidau amino hanfodol hyn neu'r defnydd o ffynonellau eraill (glwcos neu asid lactig) i ategu'r cylch TCA (Ffigur S5B). Dangosodd PNs sy'n brin o OXPHOS hefyd gynnydd mewn gweithgareddau dadelfennu glwtamin a thrawsamineiddio yn 8 wythnos oed, y gellir ei adlewyrchu gan yr uwchreoleiddio o'r ensymau mitocondriaidd glwtaminase (GLS) a glwtamin pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Ffigur 3, A a C). Mae'n werth nodi bod yr uwch-reoleiddio o GLS wedi'i gyfyngu i'r isoform sbleisiod glwtaminase C (GLS-GAC) (mae'r newid yn Mfn2cKO/CTRL tua 4.5 gwaith, P = 0.05), a gall ei uwch-reoleiddio penodol mewn meinweoedd canser gynnal bio-ynni mitocondriaidd. (27).
(A) Mae'r map gwres yn dangos y newid plyg yn lefel y protein ar gyfer y llwybr penodedig ar ôl 8 wythnos. (B) Enghraifft o dafell serebelar wedi'i labelu ag gwrthgorff gwrth-PCx (bar graddfa, 20 μm). Mae'r saeth felen yn pwyntio at gorff celloedd Purkinje. (C) Dadansoddiad mynegiant protein cwrs amser wedi'i nodi fel ymgeisydd pwysig ar gyfer atherosglerosis (prawf-t lluosog, *FDR <5%; n = 3-5 llygoden). (D) Uchod: Diagram sgematig yn dangos y gwahanol ffyrdd o fynd i mewn i'r carbon wedi'i labelu sydd wedi'i gynnwys yn yr olrheinydd [1-13C]pyruvad (h.y., trwy PDH neu lwybr traws-arterol). Gwaelod: Mae'r siart ffidil yn dangos canran y carbon wedi'i labelu'n sengl (M1) wedi'i drawsnewid yn asid aspartig, asid citrig ac asid malic ar ôl labelu sleisys serebelar acíwt gyda [1-13C]pyruvad (prawf-t wedi'i baru; ** P <0.01). (E) Dadansoddiad hanes amser cynhwysfawr o'r llwybr a nodwyd. Ystyriwch broteinau â P<0.05 yn unig ar ôl 8 wythnos. Llinell doredig: dim gwerth addasu (dadansoddiad amrywiant dwyffordd; * P <0.05; *** P <0.001). Mynegir data fel cymedr ± SEM.
Yn ein dadansoddiad ni, mae cataboliaeth BCAA wedi dod yn un o'r llwybrau uwch-reoleiddio allweddol. Mae'r ffaith hon yn awgrymu'n gryf y gallai'r gyfaint awyru sy'n mynd i mewn i'r cylch TCA gael ei newid mewn PN sydd heb OXPHOS. Gall hyn gynrychioli prif ffurf o ailweirio metabolaidd niwronau, a allai gael effaith uniongyrchol ar ffisioleg niwronau a goroesiad yn ystod cynnal camweithrediad OXPHOS difrifol. Yn gyson â'r ddamcaniaeth hon, gwelsom fod y prif ensym gwrth-atherosglerotig PCx yn cael ei uwch-reoleiddio (mae Mfn2cKO/CTRL yn newid tua 1.5 gwaith; Ffigur 3A), sy'n cataleiddio trosi pyruvat i oxaloacetate (28), y credir ei fod mewn meinwe'r ymennydd. Mae'r mynegiant yn gyfyngedig i astrocytes (29, 30). Yn gyson â'r canlyniadau proteomeg, dangosodd microsgopeg gonffocal fod mynegiant PCx wedi cynyddu'n benodol ac yn sylweddol mewn PNs diffygiol o ran OXPHOS, tra bod adweithedd PCx wedi'i gyfyngu'n bennaf i gelloedd glial Bergmann cyfagos y rheolydd (Ffigur 3B). Er mwyn profi'n swyddogaethol yr uwchreoleiddio a welwyd o PCx, fe wnaethom drin sleisys serebelar acíwt gydag olrheinydd pyruvat [1-13C]. Pan gafodd pyruvat ei ocsideiddio gan pyruvate dehydrogenase (PDH), diflannodd ei label isotop, ond caiff ei ymgorffori yn y canolradd cylchred TCA pan gaiff pyruvat ei fetaboli gan adweithiau fasgwlaidd (Ffigur 3D). I gefnogi ein data proteomeg, gwelsom nifer fawr o farcwyr o'r olrheinydd hwn yn asid aspartig sleisys Mfn2cKO, tra bod gan asid citrig ac asid malic duedd gymedrol hefyd, er nad oedd yn arwyddocaol (Ffigur 3D).
Yn niwronau dopamin llygod MitoPark â chamweithrediad mitocondriaidd a achosir gan niwronau dopamin yn dinistrio'r genyn ffactor trawsgrifio mitocondriaidd A (Tfam) yn benodol (Ffigur S6B), roedd mynegiant PCx hefyd wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol (31), sy'n dangos bod arteriosclerosis asid aseton yn digwydd. Mae digwyddiad y clefyd yn cael ei reoleiddio yn ystod camweithrediad OXPHOS niwronaidd yn y corff. Mae'n werth nodi ei fod wedi'i ganfod bod ensymau unigryw (32-34) a all gael eu mynegi mewn niwronau a all fod yn gysylltiedig ag arteriosclerosis wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddol mewn niwronau sy'n brin o OXPHOS, megis carboxylase propionyl-CoA (PCC-A), mae Malonyl-CoA yn trosi propionyl-CoA yn succinyl-CoA ac ensym malic mitocondriaidd 3 (ME3), y mae ei brif rôl yw adfer pyruvat o malat (Ffigur 3, A a C) (33, 35). Yn ogystal, gwelsom gynnydd sylweddol yn yr ensym Pdk3, sy'n ffosfforyleiddio ac felly'n anactifadu PDH (36), tra na chanfuwyd unrhyw newidiadau yn yr ensym Pdp1 sy'n actifadu PDH na'r cymhlyg ensym PDH ei hun (Ffigur 3A). Yn gyson, mewn PNs Mern2cKO, gwellwyd ffosfforyleiddiad is-uned α1 α (PDHE1α) o gydran pyruvate dehydrogenase E1 y cymhlyg PDH yn Ser293 (sy'n hysbys am atal gweithgaredd ensym PDH) (Ffigur S6C) (Ffigur S6C). Nid oes gan Pyruvate fynediad fasgwlaidd.
Yn olaf, gwelsom fod llwybr uwch biosynthesis serin a glysin, y cylch ffolad mitocondriaidd cysylltiedig (1C) a biosynthesis prolin (Ffigur 1G a Ffigur S5C) i gyd yn cael eu huwchreoleiddio'n sylweddol, yn ôl adroddiadau, yn ystod y broses actifadu. Mae'r meinweoedd cyfagos yn cael eu actifadu gydag analluedd mitocondriaidd (5-7). Dangosodd dadansoddiad confocal sy'n cefnogi'r data proteomeg hyn, mewn PN gydag OXPHOS ar goll, fod sleisys serebelar llygod 8 wythnos oed wedi cael eu rhoi dan serin hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), ensym allweddol yn y cylch ffolad mitocondriaidd. Ymateb imiwnedd sylweddol (Ffigur S5D). Mewn 13 sleisys serebelar acíwt a ddeorwyd â CU-glwcos, cadarnhaodd arbrofion olrhain metabolaidd ymhellach yr uwchreoleiddio o biosynthesis serin a prolin, gan nodi bod fflwcs isoformau carbon i serin a prolin wedi cynyddu (Ffigur S5E). Gan fod yr adweithiau a hyrwyddir gan GLS a GPT2 yn gyfrifol am synthesis glwtamad o glwtamin a'r trawsamineiddio rhwng glwtamad ac α-ketoglwtarad, mae eu huchreoleiddio yn dangos bod gan niwronau sy'n ddiffygiol o OXPHOS alw cynyddol am glwtamad. Gall hyn fod wedi'i anelu at gynnal y biosynthesis cynyddol o prolin (Ffigur S5C). Mewn cyferbyniad â'r newidiadau hyn, dangosodd dadansoddiad proteomig o astrocytau serebelar o lygod Mfn2cKO penodol i PN nad oedd y llwybrau hyn (gan gynnwys yr holl wrthberocsidasau) wedi newid yn sylweddol o ran mynegiant, gan ddangos felly fod yr ailgyfeirio metabolig hwn yn ddetholus i PN wedi'i ddiraddio (Ffig. S6, D i G).
I grynhoi, datgelodd y dadansoddiadau hyn batrymau gwahanol iawn o actifadu llwybrau metabolaidd penodol dros amser mewn niwronau coronaidd. Er y gall swyddogaeth mitocondriaidd niwronaidd annormal arwain at atherosglerosis cynnar ac ailfodelu 1C (Ffigur 3E a Ffigur S5C), a hyd yn oed newidiadau rhagweladwy yn mynegiant cyfadeiladau I ac IV, dim ond yn y camau hwyr y daeth y newidiadau mewn synthesis serine de novo yn amlwg. Camweithrediad OXPHOS (Ffigur 3E a Ffigur S5C). Mae'r canfyddiadau hyn yn diffinio proses ddilyniannol lle mae'r mitocondriaidd a achosir gan straen (cylchred 1C) a'r cytoplasmig (biosynthesis serine) yn ymateb yn synergaidd â'r cynnydd mewn atherosglerosis yn y cylchred TCA i ail-lunio metaboledd niwronaidd.
Gall niwronau coronaidd wyth wythnos oed sy'n ddiffygiol o ran OXPHOS gynnal gweithgaredd cyffroi amledd uchel a chael ailgysylltiad metabolig sylweddol i wneud iawn am gamweithrediad mitocondriaidd. Mae'r darganfyddiad hwn yn codi posibilrwydd diddorol y gallai'r celloedd hyn, hyd yn oed ar hyn o bryd, hefyd dderbyn ymyrraeth therapiwtig i ohirio neu atal niwroddirywiad. Yn hwyr. Datrysom y posibilrwydd hwn trwy ddau ymyrraeth annibynnol. Yn y dull cyntaf, dyluniwyd fector firws cysylltiedig ag adeno sy'n ddibynnol ar Cre (AAV) fel y gellir mynegi MFN2 yn ddetholus mewn niwronau coronaidd oxphos yn vivo (Ffigur S7A). Gwiriwyd yr AAV sy'n amgodio MFN2 a'r genyn gohebydd fflwroleuol mCherry (Mfn2-AAV) mewn diwylliannau niwron cynradd yn vitro, a achosodd i MFN2 gael ei fynegi mewn modd sy'n ddibynnol ar Cre ac achub y morffoleg mitocondriaidd, a thrwy hynny atal niwromwtaniad mewn niwronau Mfn2cKO (Ffigur S7, B, D ac E). Nesaf, cynhaliwyd arbrofion in vivo i gyflwyno Mfn2-AAV 8 wythnos oed yn stereotactig i gortecs serebelar llygod Mfn2cKO a llygod rheoli, a dadansoddwyd llygod 12 wythnos oed (Ffigur 4A). Bu farw'r llygod Mfn2cKO a gafodd eu trin (Ffigur 1, A a B) (16). Arweiniodd trawsdwythiad firaol in vivo at fynegiant dethol o PN mewn rhai cylchoedd serebelar (Ffigur S7, G a H). Ni chafodd chwistrelliad yr AAV rheoli sy'n mynegi mCherry yn unig (Ctrl-AAV) unrhyw effaith sylweddol ar radd y niwroddirywiad mewn anifeiliaid Mfn2cKO. Mewn cyferbyniad, dangosodd dadansoddiad o Mfn2cKOs a drawsdwythwyd gyda Mfn2-AAV effaith amddiffynnol sylweddol yr haen gelloedd PN (Ffigur 4, B a C). Yn benodol, mae'n ymddangos bod dwysedd y niwronau bron yn anwahanadwy o'r anifeiliaid rheoli (Ffigur 4, B a C, a Ffigur S7, H ac I). Mae mynegiant MFN1 ond nid MFN2 yr un mor effeithiol wrth achub marwolaeth niwronau (Ffigur 4C a Ffigur S7, C ac F), sy'n dangos y gall mynegiant MFN1 ectopig ategu'r diffyg MFN2 yn effeithiol. Dangosodd dadansoddiad pellach ar lefel PN sengl fod Mfn2-AAV wedi achub uwchstrwythur mitochondria i raddau helaeth, wedi normaleiddio lefelau mtDNA, ac wedi gwrthdroi mynegiant uchel y marcwr gwrth-angiogenesis PCx ​​(Ffigur 4, C i E). Dangosodd archwiliad gweledol o'r llygod Mfn2cKO a achubwyd mewn cyflwr gorffwys fod eu symptomau ystum a modur (symudiad S1 i S3) wedi gwella. I gloi, mae'r arbrofion hyn yn dangos bod ailgyflwyno MFN2 mewn PNs sydd â diffyg difrifol o OXPHOS yn ddigonol i wrthdroi'r defnydd o mtDNA ac ysgogi atherosglerosis, a thrwy hynny atal dirywiad axon a marwolaeth niwronau in vivo.
(A) Cynllun sy'n dangos yr amserlen arbrofol ar gyfer chwistrellu AAV sy'n amgodio MFN2 pan fydd y llwybr metabolaidd a nodir yn cael ei actifadu. (B) Delweddau confocal cynrychioliadol o sleisys serebelar 12 wythnos oed wedi'u trawsdwyso ar 8 wythnos mewn llygod Mfn2cKO ac wedi'u labelu ag gwrthgorff gwrth-Calbindin. Dde: Graddfa ffibrau axon. Graddfa chwyddo'r axon yw 450 a 75 μm. (C) Chwith: Mesur dwysedd celloedd Purkinje yn y ddolen drawsdwyso AAV (AAV+) (dadansoddiad unffordd o amrywiant; n = 3 llygoden). Dde: dadansoddiad ffocws mtDNA mewn PN trawsdwyso yn wythnos 12 (prawf-t heb ei baru; n = 6 cell o dair llygoden). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Micrograffau electron trosglwyddo cynrychioliadol o PNs o adrannau serebelar Mfn2cKO wedi'u trawsdwyso gyda'r fectorau firaol a nodir. Mae'r mwgwd pinc yn dangos yr arwynebedd sydd wedi'i feddiannu gan dendritau, ac mae'r sgwâr dotiog melyn yn dangos y chwyddo a ddarperir ar y dde; mae n yn cynrychioli'r niwclews. Bar graddfa, 1μm. Mae (E) yn dangos enghraifft o staenio PCx mewn PN wedi'i drawsdwytho ar ôl 12 wythnos. Bar graddfa, 20μm. OE, gorfynegiant; FC, newid plyg.
Yn olaf, fe wnaethom ymchwilio i bwysigrwydd goroesiad celloedd a achosir gan berocsidase mewn niwro-genau sydd wedi profi camweithrediad OXPHOS. Fe wnaethom gynhyrchu mCherry sy'n amgodio AAV-shRNA (RNA pin byr) yn targedu mRNA PCx llygoden yn benodol (AAV-shPCx), a chwistrellu'r firws neu ei reolaeth wedi'i sgramblo (AAV-scr) i serebelwm llygod Mfn2cKO. Perfformiwyd y pigiad yn ystod pedwaredd wythnos oed (Ffigur 5A) i gyflawni dileu PCx yn effeithiol yn ystod y cyfnod pan gynyddodd mynegiant PCx (Ffigur 3C) ac roedd yr haen celloedd PN yn dal yn gyfan (Ffigur 1A). Mae'n werth nodi bod dileu PCx (Ffigur S8A) yn arwain at gyflymiad sylweddol o farwolaeth PN, sy'n gyfyngedig i'r cylch heintiedig (Ffigur 5, B a C). Er mwyn deall mecanwaith yr effeithiau metabolaidd a achosir gan uwch-reoleiddio PCx, fe wnaethom astudio statws redoks niwronau ... Pan gafodd mynegiant PCx ei ostwng, cynyddodd canran y PNs Mfn2cKO a oedd yn dangos cyflwr ocsidiedig iawn fwy na thair gwaith (Ffigur 5E), sy'n dangos bod uwch-reoleiddio PCx wedi cynnal capasiti redox niwronau dirywiedig.
(A) Cynllun sy'n dangos yr amserlen arbrofol ar gyfer chwistrellu AAV sy'n amgodio shPCx pan fydd y llwybr metabolaidd a nodir yn cael ei actifadu. (B) Ffotograffau confocal cynrychioliadol o adrannau serebelar 8 wythnos oed mewn llygod Mfn2cKO wedi'u trawsdwyso a'u labelu ag gwrthgorff gwrth-galcineurin ar ôl 4 wythnos. Bar graddfa, 450μm. (C) Mesur dwysedd celloedd Purkinje mewn dolenni a drawsdwyswyd gan AAV (dadansoddiad unffordd o amrywiant; n = 3 i 4 llygoden). Mynegir data fel cymedr ± SEM; ***P <0.001. (D) Mae llun FLIM cynrychioliadol yn dangos hyd oes cyfartalog synhwyrydd redoks glutathione PN 7 wythnos oed Grx1-roGFP2 o dan yr amodau arbrofol penodedig. Cymhareb LUT (tabl edrych): cyfwng amser goroesi (mewn picosecondau). Bar graddfa, 25μm. (E) Mae'r histogram yn dangos dosbarthiad gwerthoedd oes Grx1-roGFP2 o (D) (n=158 i 368 o gelloedd mewn dau lygoden o dan bob cyflwr). Mae'r siart cylch uwchben pob histogram: yn dangos nifer y celloedd â gwerthoedd oes sylweddol hirach (coch, ocsidiedig) neu fyrrach (glas, wedi'u lleihau), sy'n fwy nag 1 SD o'r gwerth oes cyfartalog yn CTRL-AAV-scr. (F) Mae'r model arfaethedig yn dangos effaith amddiffynnol uwchreoleiddio PCx niwronaidd.
At ei gilydd, mae'r data a ddarparwn yma yn dangos y gall ail-fynegiant MFN2 achub niwrodras niwrolegol datblygedig yn llwyr gyda diffyg OXPHOS difrifol, disbyddu mtDNA difrifol, a morffoleg tebyg i ista annormal iawn, a thrwy hynny ddarparu cynnydd parhaus hyd yn oed mewn clefydau datblygedig. Mae niwroddirywiad yn darparu tystiolaeth gildroadwy o'r cam cyn marwolaeth celloedd. Mae'r radd hon o hyblygrwydd metabolig yn cael ei phwysleisio ymhellach gan allu niwronau i ysgogi atherosglerosis (ailweirio'r cylch TCA), sy'n atal mynegiant PCx mewn niwronau niwrolegol sy'n brin o OXPHOS ac yn gwella marwolaeth celloedd, a thrwy hynny'n chwarae rôl amddiffynnol (Ffigur 5F).
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddarparu tystiolaeth bod ymateb niwronau niwronau i gamweithrediad OXPHOS yn cydgyfeirio'n raddol i atherosglerosis cylchred TCA trwy'r llwybr actifadu gwahaniaethol a actifadu gan raglenni metabolaidd. Fe wnaethom gadarnhau'r dadansoddiad proteomig gyda llawer o ddulliau cyflenwol a datgelu, pan gânt eu herio gan gamweithrediad mitocondriaidd difrifol, fod gan niwronau ffurf anhysbys o'r blaen o hydwythedd metabolaidd. I'n syndod, nid yw'r broses ailweirio gyfan o reidrwydd yn nodi'r cyflwr metabolaidd terfynol sy'n cyd-fynd â niwroddirywiad yn raddol ac yn anwrthdroadwy, ond mae ein data'n awgrymu y gallai fod yn niwron cynnal a chadw hyd yn oed yn y cam cyn marwolaeth celloedd. Mecanwaith iawndal swyddogaethol. Mae'r canfyddiad hwn yn dangos bod gan niwronau radd sylweddol o blastigrwydd metabolaidd yn y corff. Mae'r ffaith hon yn profi y gall ailgyflwyno MFN2 yn ddiweddarach wrthdroi mynegiant marcwyr metabolaidd allweddol ac atal dirywiad niwronau ...
Un o'r canfyddiadau mwyaf diddorol yn ein hymchwil yw y gall niwronau niwronaidd sy'n brin o OXPHOS addasu metaboledd y cylchred TCA trwy uwchreoleiddio ensymau sy'n ysgogi arteriosclerosis yn benodol. Mae aildrefnu metabolaidd yn nodwedd gyffredin o gelloedd canser, ac mae rhai ohonynt yn dibynnu ar glwtamin i ategu canolradd cylchred TCA i gynhyrchu cywerthyddion lleihau, sy'n gyrru'r gadwyn resbiradol ac yn cynnal cynhyrchiad rhagflaenwyr biosynthesis lipid a niwcleotid (39, 40). Dangosodd astudiaeth ddiweddar, mewn meinweoedd ymylol sy'n profi camweithrediad OXPHOS, fod ailgysylltu metaboledd glwtamin/glwtamad hefyd yn nodwedd amlwg (5, 41), lle mae cyfeiriad mynediad glwtamin i'r cylchred TCA yn dibynnu ar Oherwydd difrifoldeb anaf OXPHOS (41). Fodd bynnag, nid oes digon o dystiolaeth glir ar unrhyw debygrwydd plastigedd metabolaidd niwronaidd yn y corff a'i berthnasedd posibl yng nghyd-destun y clefyd. Mewn astudiaeth in vitro ddiweddar, dangoswyd bod niwronau cortigol cynradd yn symud pyllau glwtamad ar gyfer niwrodrosglwyddiad, a thrwy hynny'n hyrwyddo metaboledd ocsideiddiol ac atherosglerosis o dan amodau straen metabolaidd (42). Mae'n werth nodi, o dan ataliad ffarmacolegol yr ensym cylchred TCA, swcsinat dehydrogenase, y gred yw bod carboxylation pyruvate yn cynnal synthesis ocsaloacetate mewn niwronau gronynnog serebelar wedi'u meithrin (34). Fodd bynnag, mae perthnasedd ffisiolegol y mecanweithiau hyn i feinwe'r ymennydd (lle credir bod atherosglerosis wedi'i gyfyngu'n bennaf i astrocytes) yn dal i fod ag arwyddocâd ffisiolegol pwysig (43). Yn yr achos hwn, mae ein data yn dangos y gellir newid PNs sydd wedi'u difrodi gan OXPHOS yn y corff i ddiraddio BCAA a charboxylation pyruvate, sef y ddau brif ffynhonnell atchwanegiadau canolradd cronfa TCA. Er bod cyfraniad tybiedig cataboliaeth BCAA i fetaboledd ynni niwronaidd wedi'i gynnig, yn ogystal â rôl glwtamad a GABA ar gyfer niwrodrosglwyddiad (44), nid oes tystiolaeth o hyd ar gyfer y mecanweithiau hyn in vivo. Felly, mae'n hawdd dyfalu y gall PNs camweithredol wneud iawn yn awtomatig am y defnydd o ganolradd TCA a yrrir gan y broses gymathu trwy gynyddu atherosglerosis. Yn benodol, efallai y bydd angen uwchreoleiddio PCx i gynnal galw cynyddol am asid aspartig, a awgrymir mewn celloedd sy'n lluosogi â chamweithrediad mitocondriaidd (45). Fodd bynnag, ni ddatgelodd ein dadansoddiad metabolomeg unrhyw newidiadau sylweddol yn lefel cyflwr cyson asid aspartig mewn niwronau niwtronau Mfn2cKO (Ffigur S6A), sydd yn ôl pob tebyg yn adlewyrchu'r defnydd metabolaidd gwahanol o asid aspartig rhwng celloedd sy'n lluosogi a niwronau ôl-mitotig. Er bod union fecanwaith uwchreoleiddio PCx mewn niwronau camweithredol in vivo i'w nodweddu o hyd, dangoswyd bod yr ymateb cynamserol hwn yn chwarae rhan bwysig wrth gynnal cyflwr redox niwronau, a ddangoswyd mewn arbrofion FLIM ar sleisys serebelar. Yn benodol, gall atal niwronau niwtronau rhag uwchreoleiddio PCx arwain at gyflwr mwy ocsidiedig a chyflymu marwolaeth celloedd. Nid yw actifadu diraddio BCAA a charboxyleiddio pyruvat yn ffyrdd o nodweddu meinweoedd ymylol camweithrediad mitocondriaidd (7). Felly, ymddengys eu bod yn nodwedd flaenoriaeth o niwronau sy'n ddiffygiol o ran OXPHOS, hyd yn oed os nad yr unig nodwedd, sy'n bwysig ar gyfer niwroddirywiad.
Mae clefyd serebelar yn fath heterogenaidd o glefyd niwroddirywiol sydd fel arfer yn amlygu fel ataxia ac yn aml yn niweidio celloedd pancreatig (46). Mae'r boblogaeth niwron hon yn arbennig o agored i gamweithrediad mitocondriaidd oherwydd bod eu dirywiad dethol mewn llygod yn ddigonol i atgynhyrchu llawer o'r symptomau modur sy'n nodweddu ataxia spinocerebelar dynol (16, 47, 48). Yn ôl adroddiadau, mae model llygoden drawsgenig gyda genyn mwtant yn gysylltiedig ag ataxia spinocerebelar dynol ac mae ganddo gamweithrediad mitocondriaidd (49, 50), gan bwysleisio pwysigrwydd astudio canlyniadau diffyg OXPHOS mewn PNPH. Felly, mae'n arbennig o addas i ynysu ac astudio'r boblogaeth niwron unigryw hon yn effeithiol. Fodd bynnag, o ystyried bod PNs yn sensitif iawn i bwysau ac yn cyfrif am gyfran isel o gyfanswm y boblogaeth celloedd serebelar, ar gyfer llawer o astudiaethau sy'n seiliedig ar omics, mae eu gwahanu'n ddetholus fel celloedd cyfan yn dal i fod yn agwedd heriol. Er ei bod bron yn amhosibl cyflawni diffyg halogiad llwyr o fathau eraill o gelloedd (yn enwedig meinweoedd oedolion), fe wnaethom gyfuno cam daduniad effeithiol gyda FACS i gael nifer digonol o niwronau hyfyw ar gyfer dadansoddiad proteomeg i lawr yr afon, ac mae gennym orchudd protein eithaf uchel (tua 3000 o broteinau) o'i gymharu â'r set ddata bresennol o'r serebelwm cyfan (51). Trwy gadw hyfywedd celloedd cyfan, mae'r dull a ddarparwn yma yn caniatáu inni nid yn unig wirio'r newidiadau yn y llwybrau metabolaidd yn y mitochondria, ond hefyd i wirio'r newidiadau yn ei gymheiriaid cytoplasmig, sy'n ategu'r defnydd o dagiau pilen mitocondriaidd i gyfoethogi math celloedd Y dull newydd ar gyfer nifer y mitochondria mewn meinweoedd cymhleth (52, 53). Nid yn unig y mae'r dull a ddisgrifiwn yn gysylltiedig ag astudio celloedd Purkinje, ond gellir ei gymhwyso'n hawdd i unrhyw fath o gell i fynd i'r afael â newidiadau metabolaidd mewn ymennydd heintiedig, gan gynnwys modelau eraill o gamweithrediad mitocondriaidd.
Yn olaf, rydym wedi nodi ffenestr therapiwtig yn ystod y broses aildrefnu metabolig hon a all wrthdroi arwyddion allweddol straen cellog yn llwyr ac atal dirywiad niwronau. Felly, gall deall goblygiadau swyddogaethol yr ailweirio a ddisgrifir yma ddarparu cipolwg sylfaenol ar driniaethau posibl ar gyfer cynnal hyfywedd niwronau yn ystod camweithrediad mitocondriaidd. Mae angen ymchwil yn y dyfodol sydd â'r nod o ddadansoddi newidiadau mewn metaboledd ynni mewn mathau eraill o gelloedd yr ymennydd i ddatgelu'n llawn gymhwysedd yr egwyddor hon i glefydau niwrolegol eraill.
Disgrifiwyd llygod MitoPark o'r blaen (31). Disgrifiwyd llygod C57BL/6N gyda genynnau Mfn2 loxP yn ffinio â nhw o'r blaen (18) a'u croesi â llygod L7-Cre (23). Yna croeswyd yr epil heterosygaidd dwbl canlyniadol â llygod Mfn2loxP/Mfn2loxP homosygaidd i gynhyrchu cnoc-outs genynnau penodol i Purkinje ar gyfer Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Mewn is-set o baru, cyflwynwyd yr alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) trwy groesiadau ychwanegol (20). Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â chanllawiau Ewropeaidd, cenedlaethol a sefydliadol a'u cymeradwyo gan LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Gogledd Rhine-Westphalia, yr Almaen. Mae gwaith anifeiliaid hefyd yn dilyn canllawiau Ffederasiwn Ewropeaidd Cymdeithasau Gwyddorau Anifeiliaid Labordy.
Ar ôl anestheteiddio dadleoliad serfigol y fenyw feichiog, ynyswyd embryo'r llygoden (E13). Cafodd y cortecs ei ddyrannu mewn Toddiant Halen Cytbwys Hanks (HBSS) wedi'i ategu â 10 mM Hepes a'i basio ymlaen i Gyfrwng Eryr wedi'i Addasu Dulbecco sy'n cynnwys papain (20 U/ml) a systein (1μg/ml). Deorwch y meinwe mewn DMEM) a'i daduno trwy dreuliad ensymatig. Ml) ar 37°C am 20 munud, ac yna ei falu'n fecanyddol mewn DMEM wedi'i ategu â 10% serwm ffetws buchol. Hadwyd celloedd ar orchuddion gwydr wedi'u gorchuddio â polylysin ar ddwysedd o 2 × 106 fesul dysgl ddiwylliant 6 cm neu ar ddwysedd o 0.5 × 105 celloedd/cm2 ar gyfer dadansoddi delweddu. Ar ôl 4 awr, disodlwyd y cyfrwng â chyfrwng di-serwm Neurobasal yn cynnwys 1% atchwanegiad B27 a 0.5 mM GlutaMax. Yna cadwyd y niwronau ar 37°C a 5% CO2 drwy gydol yr arbrawf, a'u bwydo unwaith yr wythnos. Er mwyn ysgogi ailgyfuno in vitro, defnyddiwyd 3μl (dysgl diwylliant 24-ffynnon) neu 0.5μl (plât 24-ffynnon) o'r fector firws AAV9 canlynol i drin niwronau ar yr ail ddiwrnod in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, rhif catalog 105530-AAV9) ac AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, rhif catalog 105545-AAV9).
Mae DNA cyflenwol Mfn1 ac Mfn2 llygoden (a gafwyd o blasmid Addgene #23212 a #23213, yn y drefn honno) wedi'u marcio â'r dilyniant V5 (GKPIPNPLLGLDST) ar y derfynfa C, ac maent wedi'u hasio ag mCherry yn y ffrâm trwy'r dilyniant T2A. Mae Grx1-roGFP2 yn rhodd gan Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Trwy ddisodli'r casét tdTomato gan ddefnyddio dulliau clonio confensiynol, is-gloniwyd y casét i mewn i asgwrn cefn pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (rhif cyfeirnod Addgene 28306) i gynhyrchu fectorau pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 a pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Defnyddiwyd strategaeth debyg i gynhyrchu'r fector rheoli pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Er mwyn cynhyrchu'r adeiledd AAV-shPCx, mae angen fector plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), sy'n cynnwys y dilyniant DNA sy'n amgodio'r shRNA sy'n targedu PCx llygoden (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). O dan reolaeth yr hyrwyddwr U6, defnyddir mCherry o dan reolaeth yr hyrwyddwr CMV. Cynhaliwyd cynhyrchu fectorau AAV ategol yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Cell Biolabs). Yn fyr, defnyddiwch blasmid trosglwyddo sy'n cario mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) dros dro. Trawsffurfiad celloedd 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) neu Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) dros dro, yn ogystal â chodio protein capsid AAV1 a phrotein ategol. Pecynnu plasmid plasmid, gan ddefnyddio'r dull calsiwm ffosffad. Cafwyd uwchnofant y firws crai trwy gylchoedd rhewi-dadmer mewn baddon iâ sych/ethanol a lyswyd celloedd mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Purowyd y fector AAV drwy uwch-ganrifugio graddiant ïodixanol ysbeidiol (24 awr ar 32,000 rpm a 4°C) a'i grynhoi gan ddefnyddio hidlydd allgyrchol Amicon ultra-15. Cafodd titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 copi genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX fel y disgrifiwyd yn flaenorol (54), wedi'i fesur drwy PCR meintiol amser real (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ac AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Cafodd y niwronau cynradd eu crafu i ffwrdd mewn 1x PBS oerfel iâ, eu pelenni, ac yna eu homogeneiddio mewn byffer lysis 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodiwm deoxycholate/PBS yn cynnwys ffosffatase ac atalydd proteas (Roche). Perfformiwyd meintioli protein trwy ddefnyddio'r assay asid bicinchoninig (Thermo Fisher Scientific). Yna gwahanwyd y proteinau trwy electrophoresis gel SDS-polyacrylamide, ac yna eu blotio ar bilen polyfinylidene fflworid (GE Healthcare). Blociwch safleoedd amhenodol a deori gyda'r gwrthgorff cynradd (gweler Tabl S1 am fanylion) mewn llaeth 5% mewn TBST (hallwyn wedi'i fwfferio â Tris gyda Tween), camau golchi ac gwrthgorff eilaidd yn TBST Incubate. Deori gyda'r gwrthgorff cynradd dros nos ar +4°C. Ar ôl golchi, rhowch yr gwrthgorff eilaidd am 2 awr ar dymheredd ystafell. Wedi hynny, trwy ddeori'r un blot gydag gwrthgorff gwrth-β-actin, cadarnhawyd yr un llwyth. Canfod trwy drosi i gemiluminescence a gwella cemiluminescence (GE Healthcare).
Cafodd y niwronau a oedd wedi'u hau ar orchuddion gwydr eu gosod gyda 4% paraformaldehyd (PFA)/PBS ar yr adeg benodol ar dymheredd ystafell am 10 munud. Yn gyntaf, caiff y orchuddion eu treiddio gyda 0.1% Triton X-100/PBS am 5 munud ar dymheredd ystafell, ac yna mewn byffer blocio [3% albwmin serwm buchol (BSA)/PBS]. Ar yr ail ddiwrnod, golchwyd y orchuddion gyda byffer blocio a'u magu gyda'r gwrthgorff eilaidd cysylltiedig â fflworoffor priodol am 2 awr ar dymheredd ystafell; yn olaf, golchwyd y samplau'n drylwyr mewn PBS gyda 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) wedi'i wrth-liwio ac yna eu gosod ar y sleid microsgop gydag Aqua-Poly/Mount.
Cafodd llygod (gwryw a benyw) eu hanestheteiddio trwy chwistrelliad intraperitoneol o ketamin (130 mg/kg) a xylazine (10 mg/kg) a'u rhoi'n isgroenol gydag analgesig carprofen (5 mg/kg), a'u rhoi mewn offeryn stereotactig (Kopf) wedi'i gyfarparu â pad cynnes. Datgelwch y benglog a defnyddiwch ddril deintyddol i deneuo'r rhan o'r cortecs serebelar sy'n cyfateb i'r asgwrn mis (o lambda: cynffon 1.8, ochrol 1, sy'n cyfateb i lobules IV a V). Defnyddiwch nodwydd chwistrell grwm i greu twll bach yn y benglog yn ofalus i osgoi tarfu ar y fasgwlariaeth isod. Yna caiff y capilar gwydr tenau ei fewnosod yn araf i'r micro-dwll (o -1.3 i -1 ar ochr fentrol y dura mater), a chwistrellir 200 i 300 nl AAV i'r micro-chwistrellwr (Narishige) gyda chwistrelli â llaw (Narishige) sawl gwaith ar bwysedd isel dros gyfnod o amser ffenestr 10 i 20 munud. Ar ôl y trwyth, rhowch y capilar am 10 munud arall i ganiatáu i'r firws ledaenu'n llwyr. Ar ôl tynnu'r capilarïau allan, caiff y croen ei bwytho'n ofalus i leihau llid y clwyf a chaniatáu i'r anifail wella. Cafodd yr anifeiliaid eu trin ag analgesig poen (caspofen) am sawl diwrnod ar ôl y llawdriniaeth, ac yn ystod y cyfnod hwnnw cafodd eu cyflwr corfforol ei fonitro'n ofalus ac yna cawsant eu lladd ar yr adeg a nodwyd. Cynhaliwyd yr holl weithdrefnau yn unol â chanllawiau Ewropeaidd, cenedlaethol a sefydliadol a chawsant eu cymeradwyo gan LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, yr Almaen.
Cafodd yr anifeiliaid eu hanestheteiddio â chetamin (100 mg/kg) a xylasin (10 mg/kg), a chafodd y galon ei pherfwsio â 0.1 M PBS yn gyntaf, ac yna â 4% PFA mewn PBS. Cafodd y meinwe ei dyrannu a'i gosod mewn 4% PFA/PBS dros nos ar 4°C. Defnyddiwyd cyllell ddirgrynol (Leica Microsystems GmbH, Fienna, Awstria) i baratoi adrannau sagittal (50 μm o drwch) o'r ymennydd wedi'i osod mewn PBS. Oni nodir yn wahanol, perfformiwyd staenio adrannau rhydd-arnofiol fel y disgrifiwyd uchod (13) ar dymheredd ystafell a'u troi. Yn fyr, yn gyntaf, cafodd y sleisys a gafwyd eu permeabileiddio â 0.5% Triton X-100/PBS am 15 munud ar dymheredd ystafell; ar gyfer rhai epitopau (Pcx a Shmt2), trwy gynhesu'r sleisys mewn byffer tris-EDTA ar 80°C (PH 9) am 25 munud yn lle'r cam hwn. Nesaf, cafodd yr adrannau eu magu gyda gwrthgorff cynradd (gweler Tabl S1) mewn byffer blocio (3% BSA/PBS) ar 4°C dros nos gan eu cymysgu. Y diwrnod canlynol, golchwyd yr adrannau gyda byffer blocio a'u magu gyda'r gwrthgorff eilaidd priodol wedi'i gyfuno â fflworoffor am 2 awr ar dymheredd ystafell; yn olaf, golchwyd yr adrannau'n drylwyr mewn PBS, eu gwrth-liwio â DAPI, ac yna eu trwsio ag AquaPolymount ar sleid microsgop.
Defnyddiwyd microsgop confocal sganio laser (TCS SP8-X neu TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) wedi'i gyfarparu â laser golau gwyn a laser uwchfioled deuod 405 i ddelweddu'r sampl. Drwy gyffroi'r fflworoffor a chasglu'r signal gyda Synhwyrydd Hybrid (HyDs), defnyddiwyd meddalwedd LAS-X i gasglu delweddau wedi'u pentyrru yn cydymffurfio â samplu Nyquist mewn modd dilyniannol: ar gyfer paneli anfeintiol, mae'n signalau hynod ddeinamig (er enghraifft, mewn celloedd somatig a dendritau) (mtYFP) Defnyddiwch HyD i ganfod nifer y PNs mewn modd BrightR). Cymhwysir gatio o 0.3 i 6 ns i leihau'r cefndir.
Delweddu celloedd wedi'u didoli mewn amser real. Ar ôl eu didoli mewn cyfrwng Neurobasal-A yn cynnwys 1% o atchwanegiad B27 a 0.5 mM GlutaMax, hauwyd celloedd ar unwaith ar sleidiau gwydr wedi'u gorchuddio â poly-l-lysin (μ-Slide8 Well, Ibidi, rhif catalog 80826), ac yna eu cadw ar 37°C a 5% CO2 am 1 awr i ganiatáu i'r celloedd setlo. Perfformiwyd delweddu amser real ar ficrosgop sganio laser confocal Leica SP8 wedi'i gyfarparu â laser gwyn, HyD, lens amcan olew 63×[1.4 agorfa rifol (NA)] a llwyfan gwresogi.
Cafodd y llygoden ei hanestheteiddio'n gyflym â charbon deuocsid a'i thorri i ffwrdd, tynnwyd yr ymennydd yn gyflym o'r benglog, a'i thorri'n adran sagittal 200μm o drwch (ar gyfer arbrawf labelu 13C) neu 275μm o drwch (ar gyfer dau arbrawf ffoton) wedi'i llenwi â'r deunyddiau canlynol. Mae'r hufen iâ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, yr Almaen) wedi'i lenwi â'r sylweddau canlynol: 125 mM NaCl oer iâ, dirlawn â charbon (95% O2 a 5% CO2) Ca2 isel + hylif serebro-sbinol artiffisial (ACSF), 2.5 mM KCl, byffer sodiwm ffosffad 1.25 mM, 25 mM NaHCO3, 25 mM glwcos, 0.5 mM CaCl2 a 3.5 mM MgCl2 (pwysedd osmotig o 310 i 330 mmol). Trosglwyddwch y sleisys ymennydd a gafwyd i siambr cyn-ddeori sy'n cynnwys Ca2 + ACSF uwch (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, byffer sodiwm ffosffad 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glwcos, 1.0 mM CaCl2 a 2.0 mM MgCl2) Cyfrwng) pH 7.4 a 310 i 320 mmol).
Yn ystod y broses ddelweddu, symudwyd y sleisys i ystafell ddelweddu bwrpasol, a pherfformiwyd yr arbrawf o dan berfwsiad ACSF parhaus ar dymheredd cyson o 32° i 33°C. Defnyddiwyd microsgop sganio laser aml-ffoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) wedi'i gyfarparu â lens amcan Leica 25x (NA 0.95, dŵr), Ti: laser Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) ar gyfer delweddu sleisys. Modiwl FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM o Grx1-roGFP2. Mesurwyd y newidiadau yng nghyflwr redoks cytoplasmig PNs gan FLIM dau-ffoton mewn sleisys ymennydd sagittal, lle targedodd y biosynhwyrydd Grx1-roGFP2 PNs. Yn yr haen PN, dewisir y maes caffael tua 50 i 80 μm o dan wyneb y sleisen i sicrhau bod PN hyfyw (hynny yw, diffyg strwythur gleiniog neu newidiadau morffolegol niwronaidd ar hyd y dendritau) a'r synhwyrydd roGFP2 positif dwbl a'r shRNA PCx sy'n amgodio AAV neu ei ddilyniant rheoli (pob un yn cyd-fynegi mCherry). Casglwch ddelweddau pentwr sengl gyda chwyddo digidol 2x [tonfedd cyffroi: 890 nm; 512 nm 512 picsel]. Canfod: defnyddir HyD mewnol, grŵp hidlo fflworesein isothiocyanate (FITC)] a chyfartaleddu delweddau o fewn 2 i 3 munud i sicrhau bod digon o ffotonau yn cael eu casglu (cyfanswm o 1000 o ffotonau) ar gyfer ffitio cromliniau. Perfformiwyd sensitifrwydd y stiliwr Grx1-roGFP2 a gwirio amodau FLIM trwy fonitro gwerth oes roGFP2 wrth ychwanegu 10 mM H2O2 alldarddol at yr ACSF perfusion (i wneud y mwyaf o ocsideiddio, gan arwain at oes hirach), ac yna ychwanegu 2 mM dithiothreitol (yn lleihau graddfa'r gostyngiad, gan arwain at ostyngiad yn yr oes) (Ffigur S8, D i G). Defnyddiwch feddalwedd FLIMfit 5.1.1 i ddadansoddi'r canlyniadau a gafwyd, ffitio'r gromlin dadfeiliad esbonyddol sengl o'r ddelwedd gyfan i'r IRF a fesurwyd (swyddogaeth ymateb offeryn), ac mae χ2 tua 1. I gyfrifo oes PN sengl, lluniwyd y mwgwd o amgylch y corff nerf â llaw, a defnyddiwyd yr oes gyfartalog ym mhob mwgwd ar gyfer meintioli.
Dadansoddiad potensial mitocondriaidd. Ar ôl i'r adran acíwt gael ei magu gyda 100 nM o TMRM wedi'i ychwanegu'n uniongyrchol at yr ACSF wedi'i berffeithio am 30 munud, mesurwyd y newidiadau potensial mitocondriaidd mewn PNs gan ficrosgop dau-ffoton. Perfformiwyd delweddu TMRM trwy gyffroi'r stiliwr ar 920 nm a defnyddio HyD mewnol (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) i gasglu signalau; trwy ddefnyddio'r un donfedd cyffroi ond gan ddefnyddio HyD mewnol gwahanol (FITC: 525/50) i ddelweddu mtYFP. Defnyddiwch ategyn Cyfrifiannell Delwedd ImageJ i werthuso potensial mitocondriaidd ar lefel y gell sengl. Yn fyr, defnyddir yr hafaliad ategyn: signal = min (mtYFP, TMRM) i nodi'r rhanbarth mitocondriaidd sy'n dangos y signal TMRM yn Purkinje Somali yn y ddelwedd gonffocal pentwr sengl o'r sianel gyfatebol. Yna caiff arwynebedd y picsel yn y mwgwd sy'n deillio o hyn ei fesur, ac yna ei normaleiddio ar y ddelwedd pentwr sengl trothwy gyfatebol o'r sianel mtYFP i gael y ffracsiwn mitocondriaidd sy'n dangos y potensial mitocondriaidd.
Cafodd y ddelwedd ei dadgydblygu gyda meddalwedd Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Ar gyfer y lluniau wedi'u sganio o deils, gwneir montage o un deilsen gan ddefnyddio'r algorithm pwytho awtomatig a ddarperir gan feddalwedd LAS-X. Ar ôl calibro delweddau, defnyddiwch ImageJ ac Adobe Photoshop i brosesu'r ddelwedd ymhellach ac addasu'r disgleirdeb a'r cyferbyniad yn unffurf. Defnyddiwch Adobe Illustrator ar gyfer paratoi graffig.
Dadansoddiad ffocws mtDNA. Mesurwyd nifer y briwiau mtDNA ar adrannau serebelar wedi'u labelu ag gwrthgyrff yn erbyn DNA gan ddefnyddio microsgop confocal. Crëwyd pob ardal darged ar gyfer corff y gell a niwclews pob cell, a chyfrifwyd yr ardal berthnasol gan ddefnyddio'r ategyn Multi Measure (meddalwedd ImageJ). Tynnwch yr ardal niwclear o ardal corff y gell i gael yr ardal cytoplasmig. Yn olaf, defnyddiwyd yr ategyn Analyze Particles (meddalwedd ImageJ) i fesur y pwyntiau DNA cytoplasmig yn awtomatig sy'n nodi mtDNA ar y ddelwedd trothwy, a normaleiddiwyd y canlyniadau a gafwyd i gyfartaledd PN llygod CTRL. Mynegir y canlyniadau fel nifer cyfartalog y niwcleosidau fesul cell.
Dadansoddiad mynegiant protein. Defnyddiwch ategyn Cyfrifiannell Delwedd ImageJ i werthuso mynegiant protein mewn PN ar lefel y gell sengl. Yn fyr, yn y ddelwedd gonffocal un haen o'r sianel gyfatebol, trwy'r hafaliad: signal = min (mtYFP, gwrthgorff), nodir y rhanbarth mitocondriaidd sy'n dangos imiwno-adweithedd i wrthgorff penodol yn Purkina. Yna caiff yr ardal picsel yn y mwgwd canlyniadol ei meintioli, ac yna ei normaleiddio ar y ddelwedd pentwr sengl trothwy gyfatebol o'r sianel mtYFP i gael y gyfran mitocondriaidd o'r protein a ddangosir.
Dadansoddiad dwysedd celloedd Purkinje. Defnyddiwyd ategyn Cell Counter ImageJ i werthuso dwysedd Purkinje trwy rannu nifer y celloedd Purkinje a gyfrifwyd â hyd y cylch serebelar a feddiannwyd gan y celloedd a gyfrifwyd.
Paratoi a chasglu samplau. Cafodd ymennydd y grŵp rheoli a llygod Mfn2cKO eu trwsio mewn 2% PFA/2.5% glutaraldehyd mewn byffer ffosffad 0.1 M (PB), ac yna paratowyd adrannau coronaidd gan ddefnyddio ciliadau (Leica Mikrosysteme GmbH, Fienna, Awstria) (Trwch 50 i 60 μm) Yna eu trwsio mewn byffer PB mewn 1% os tetraocsid ac 1.5% potasiwm fferrocyanid ar dymheredd ystafell am 1 awr. Golchwyd yr adrannau dair gwaith â dŵr distyll, ac yna eu staenio ag ethanol 70% yn cynnwys 1% asetat wranyl am 20 munud. Yna dadhydradwyd yr adrannau mewn alcohol graddol a'u mewnosod mewn resin epocsi Durcupan ACM (resin castio Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, rhif catalog 14040) rhwng sleidiau gwydr wedi'u gorchuddio â silicon, ac yn olaf ar 60°C eu polymereiddio yn y popty am 48 awr. Dewiswyd ardal y cortecs serebelar a thorrwyd adrannau ultradenau 50 nm ar Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Fienna, Awstria) a'u pigo ar grid hollt copr 2 × 1 mm wedi'i orchuddio â ffilm polystyren. Staeniwyd yr adrannau â thoddiant o 4% asetat wranyl mewn H2O am 10 munud, eu golchi â H2O sawl gwaith, yna â sitrad plwm Reynolds mewn H2O am 10 munud, ac yna eu golchi â H2O sawl gwaith. Cymerwyd micrograffau gyda microsgop electron trawsyrru Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) gan ddefnyddio camera digidol TVIPS (System Prosesu Fideo a Delweddau Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, UDA). Yr Almaen).
Ar gyfer llygod a oedd wedi'u heintio ag AAV, gwahanwyd yr ymennydd a'i sleisio'n adran sagittal 1 mm o drwch, ac archwiliwyd y serebelwm gan ddefnyddio microsgop fflwroleuol i nodi'r cylch a heintiwyd ag AAV (hynny yw, mynegiant mCherry). Dim ond arbrofion lle mae chwistrelliad AAV yn arwain at effeithlonrwydd trawsdwythiad uchel iawn o'r haen celloedd Purkinje (h.y. bron yr haen gyfan) mewn o leiaf ddau gylch serebelar olynol a ddefnyddir. Cafodd y ddolen drawsdwythedig AAV ei microddyrannu ar gyfer ei gosod dros nos ar ôl ei sefydlu (4% PFA a 2.5% glutaraldehyd mewn byffer cocoate 0.1 M) a'i phrosesu ymhellach. Ar gyfer mewnosod EPON, golchwyd y meinwe sefydlog gyda byffer cocoate sodiwm 0.1 M (Applichem), a'i magu gyda 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) mewn byffer cocoate sodiwm 0.1 M (Applichem) am 4 awr, yna golchwyd am 2 awr. Ailadroddwch 3 gwaith gyda byffer cocamide 0.1 M. Wedi hynny, defnyddiwyd y gyfres esgynnol o ethanol i ddeori pob toddiant ethanol ar 4°C am 15 munud i ddadhydradu'r meinwe. Trosglwyddwyd y meinwe i propylen ocsid a'i deori dros nos mewn EPON (Sigma-Aldrich) ar 4°C. Rhowch y meinwe mewn EPON ffres ar dymheredd ystafell am 2 awr, ac yna ei fewnosod ar 62°C am 72 awr. Defnyddiwch uwch-ficrotom (Leica Microsystems, UC6) a chyllell ddiemwnt (Diatome, Biel, y Swistir) i dorri adrannau uwch-denau 70 nm, a'u staenio ag 1.5% asetat wranyl am 15 munud ar 37°C, a'u staenio ag toddiant sitrad plwm am 4 munud. Cymerwyd y micrograffau electron gan ddefnyddio microsgop electron trosglwyddo JEM-2100 Plus (JEOL) wedi'i gyfarparu â Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) a meddalwedd DigitalMicrograph (Gatan). Ar gyfer dadansoddi, cymerwyd micrograffau electron gyda chwyddo digidol 5000× neu 10,000×.
Dadansoddiad morffolegol o mitochondria. Ar gyfer pob dadansoddiad, amlinellwyd cyfuchliniau mitochondria unigol â llaw mewn delweddau digidol gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ. Dadansoddir gwahanol baramedrau morffolegol. Mynegir dwysedd mitochondriaidd fel canran a geir trwy rannu cyfanswm arwynebedd mitocondriaidd pob cell ag arwynebedd y cytoplasm (arwynebedd y cytoplasm = arwynebedd y gell-arwynebedd niwclews y gell) × 100. Cyfrifir crwnder mitochondria gyda'r fformiwla [4π∙(arwynebedd/perimedr 2)]. Dadansoddwyd morffoleg ista mitochondria a'i rhannu'n ddau gategori (“tiwbaidd” a “pothell”) yn ôl eu prif siapiau.
Dadansoddiad nifer a dwysedd awtoffagosom/lysosom. Defnyddiwch feddalwedd ImageJ i amlinellu cyfuchliniau pob awtoffagosom/lysosom â llaw yn y ddelwedd ddigidol. Mynegir arwynebedd yr awtoffagosom/lysosom fel canran a gyfrifir trwy rannu cyfanswm arwynebedd strwythur yr awtoffagosom/lysosom ym mhob cell ag arwynebedd y cytoplasm (arwynebedd y cytoplasm = arwynebedd y gell-arwynebedd y niwclews) × 100. Cyfrifir dwysedd yr awtoffagosom/lysosom trwy rannu'r cyfanswm â nifer y strwythurau awtoffagosom/lysosom fesul cell (o ran arwynebedd y cytoplasm) (arwynebedd y cytoplasm = arwynebedd y gell-arwynebedd y niwclews).
Labelu ar gyfer torri acíwt a pharatoi samplau. Ar gyfer arbrofion sydd angen labelu glwcos, trosglwyddwch y sleisys ymennydd acíwt i siambr cyn-ddeori, sy'n cynnwys carbon dirlawn (95% O2 a 5% CO2), ACSF Ca2 + uchel (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, byffer sodiwm ffosffad 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glwcos, 1.0 mM CaCl2 a 2.0 mM MgCl2, wedi'i addasu i pH 7.4 a 310 i 320 mOsm), lle mae glwcos yn 13C6-Amnewidiad glwcos (Eurisotop, rhif catalog CLM-1396). Ar gyfer arbrofion sydd angen labelu pyruvat, trosglwyddwch y sleisys ymennydd acíwt i Ca2 + ACSF uwch (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM byffer sodiwm ffosffad, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glwcos, 1.0 mM CaCl2 ac Ychwanegwch 2.0mM MgCl2, addaswch i pH 7.4 a 310 i 320mOsm), ac ychwanegwch 1mM 1-[1-13C]pyruvat (Eurisotop, rhif catalog CLM-1082). Deorwch yr adrannau am 90 munud ar 37°C. Ar ddiwedd yr arbrawf, golchwyd yr adrannau'n gyflym gyda hydoddiant dyfrllyd (pH 7.4) yn cynnwys 75 mM amoniwm carbonad, ac yna eu homogeneiddio mewn 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): methanol: dŵr. Ar ôl i'r adrannau gael eu magu ar rew am 30 munud, cafodd y samplau eu centrifugio ar 21,000 g am 10 munud ar 4°C, a sychwyd yr uwchnofiant clir mewn crynodydd SpeedVac. Storiwyd y belen metabolyn sych a ddeilliodd o hyn ar -80°C tan y dadansoddiad.
Dadansoddiad cromatograffaeth hylif-sbectrometreg màs o asidau amino wedi'u labelu â 13C. Ar gyfer dadansoddiad cromatograffaeth hylif-sbectrometreg màs (LC-MS), ail-ataliwyd y belen metabolyn mewn 75μl o ddŵr gradd LC-MS (Honeywell). Ar ôl allgyrchu ar 21,000 g am 5 munud ar 4°C, defnyddiwyd 20 μl o'r uwchnofiant wedi'i egluro ar gyfer dadansoddi fflwcs asid amino, tra defnyddiwyd gweddill y dyfyniad ar unwaith ar gyfer dadansoddi anionau (gweler isod). Perfformiwyd dadansoddiad asid amino gan ddefnyddio'r protocol deillio clorid bensoyl a ddisgrifiwyd yn flaenorol (55, 56). Yn y cam cyntaf, ychwanegwyd 10μl o sodiwm carbonad 100 mM (Sigma-Aldrich) at 20μl o ddyfyniad metabolyn, ac yna ychwanegwyd 10μl o glorid bensoyl 2% (Sigma-Aldrich) at yr ACN gradd LC. Cafodd y sampl ei fortecsio'n fyr ac yna ei allgyrchu ar 21,000 g am 5 munud ar 20°C. Trosglwyddwyd yr uwchnofiant clir i ffiol samplwr awtomatig 2 ml gyda mewnosodiad gwydr conigol (cyfaint 200 μl). Dadansoddwyd y samplau gan ddefnyddio system LC perfformiad uwch-uchel Acquity iClass (Waters) wedi'i chysylltu â'r sbectromedr màs manwl gywirdeb uchel Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Ar gyfer dadansoddi, chwistrellwyd 2μl o'r sampl ddeilliedig i golofn silica T3 cryfder uchel 100 × 1.0 mm (Waters) sy'n cynnwys gronynnau 1.8μm. Y gyfradd llif yw 100μl/mun, ac mae'r system byffer yn cynnwys byffer A (10 mM fformad amoniwm a 0.15% asid fformig mewn dŵr) a byffer B (ACN). Mae'r graddiant fel a ganlyn: 0%B ar 0 munud; 0%B. 0 i 15% B ar 0 i 0.1 munud; 15 i 17% B ar 0.1 i 0.5 munud; B ar 17 i 55% ar 0.5 i 14 munud; B ar 55 i 70% ar 14 i 14.5 munud; ar 14.5 i 70 i 100% B ar 18 munud; 100% B ar 18 i 19 munud; 100 i 0% B ar 19 i 19.1 munud; 0% B ar 19.1 i 28 munud (55, 56). Mae'r sbectromedr màs QE-HF yn gweithredu mewn modd ïoneiddio positif gydag ystod màs o m/z (cymhareb màs/gwefr) o 50 i 750. Y datrysiad a gymhwysir yw 60,000, a'r targed ïon rheoli enillion (AGC) a geir yw 3 × 106, a'r amser ïon mwyaf yw 100 milieiliad. Mae'r ffynhonnell ïoneiddio electrochwistrellu wedi'i gynhesu (ESI) yn gweithredu ar foltedd chwistrellu o 3.5 kV, tymheredd capilarïaidd o 250 ° C, llif aer gwain o 60 AU (unedau mympwyol), a llif aer ategol o 20 AU. 250 ° C. Mae'r lens S wedi'i osod i 60 AU.
Dadansoddiad cromatograffaeth anion-MS o asidau organig wedi'u labelu â 13C. Dadansoddwyd y gwaddod metabolyn sy'n weddill (55μl) gan ddefnyddio system cromatograffaeth ïon Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) wedi'i chysylltu â sbectromedr màs QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Yn gryno, chwistrellwyd 5μl o echdyniad metabolyn i golofn Dionex IonPac AS11-HC wedi'i chyfarparu â HPLC (2 mm × 250 mm, maint gronynnau 4μm, Thermo Fisher Scientific) mewn modd dolen rhannol gwthio i mewn gyda chymhareb llenwi o 1. Colofn gwarchod Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Cynhelir tymheredd y golofn ar 30°C, a gosodir yr awtosampler i 6°C. Defnyddiwch getris potasiwm hydrocsid a ddarperir gyda dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio i gynhyrchu graddiant potasiwm hydrocsid trwy'r generadur eluent. Gwahanu metabolion ar gyfradd llif o 380μl/mun, gan gymhwyso'r graddiant canlynol: 0 i 3 munud, 10 mM KOH; 3 i 12 munud, 10 i 50 mM KOH; 12 i 19 munud, 50 i 100 mM KOH; 19 i 21 munud, 100 mM KOH; 21 i 21.5 munud, 100 i 10 mM KOH. Ail-gydbwyswyd y golofn o dan 10 mM KOH am 8.5 munud.
Mae'r metabolion wedi'u helutio yn cael eu cyfuno â ffrwd atchwanegol isopropanol 150μl/munud ar ôl y golofn ac yna'n cael eu cyfeirio at sbectromedr màs cydraniad uchel sy'n gweithredu mewn modd ïoneiddio negatif. Mae MS yn monitro'r ystod màs o m/z 50 i 750 gyda chydraniad o 60,000. Mae'r AGC wedi'i osod i 1 × 106, a chedwir yr amser ïon mwyaf ar 100 ms. Gweithredwyd y ffynhonnell ESI wedi'i gwresogi ar foltedd chwistrellu o 3.5 kV. Dyma osodiadau eraill y ffynhonnell ïon: tymheredd capilarïaidd 275°C; llif nwy gwain, 60 AU; llif nwy ategol, 20 AU ar 300°C, a gosodiad lens S i 60 AU.
Dadansoddiad data o fetabolion wedi'u labelu â 13C. Defnyddiwch feddalwedd TraceFinder (fersiwn 4.2, Thermo Fisher Scientific) ar gyfer dadansoddi data o gymhareb isotopau. Gwiriwyd hunaniaeth pob cyfansoddyn gan gyfansoddyn cyfeirio dibynadwy a'i ddadansoddi'n annibynnol. Er mwyn cynnal dadansoddiad cyfoethogi isotopau, echdynnwyd arwynebedd y cromatogram ïon a echdynnwyd (XIC) o bob isotop 13C (Mn) o [M + H] +, lle mae n yn nifer carbon y cyfansoddyn targed, a ddefnyddir i ddadansoddi asidau amino neu [MH] + a ddefnyddir i ddadansoddi anionau. Mae cywirdeb màs XIC yn llai na phum rhan fesul miliwn, a chywirdeb RT yw 0.05 munud. Perfformir y dadansoddiad cyfoethogi trwy gyfrifo cymhareb pob isotop a ganfuwyd i swm holl isotopau'r cyfansoddyn cyfatebol. Rhoddir y cymhareb hyn fel gwerthoedd canrannol ar gyfer pob isotop, a mynegir y canlyniadau fel cyfoethogi canrannol molar (MPE), fel y disgrifiwyd yn flaenorol (42).
Cafodd y belen niwron wedi'i rhewi ei homogeneiddio mewn methanol 80% oerfel rhewllyd (v/v), ei throi'n fortecs, a'i ddeori ar -20°C am 30 munud. Trowch y sampl eto a'i droi ar +4°C am 30 munud. Cafodd y sampl ei allgyrchu ar 21,000 g am 5 munud ar 4°C, ac yna casglwyd yr uwchnofiant canlyniadol a'i sychu gan ddefnyddio crynodydd SpeedVac ar 25°C ar gyfer dadansoddiad dilynol. Fel y disgrifiwyd uchod, perfformiwyd dadansoddiad LC-MS ar asidau amino'r celloedd wedi'u didoli. Gan ddefnyddio TraceFinder (fersiwn 4.2, Thermo Fisher Scientific), perfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio màs monoisotopig pob cyfansoddyn. Perfformiwyd normaleiddio cwantol data metabolyn gan ddefnyddio'r pecyn meddalwedd preprocessCore (57).
Paratoi sleisys. Anesthetwyd y llygoden yn gyflym â charbon deuocsid a thorrwyd ei phen, tynnwyd yr ymennydd yn gyflym o'r benglog, a defnyddiwyd y gyllell ddirgrynol wedi'i llenwi â rhew (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, yr Almaen) i'w thorri'n adrannau sagittal 300 i 375 μm. Nwyeiddio carbon oer (95% O2 a 5% CO2). Ca2 + ACSF Isel (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, byffer sodiwm ffosffad 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glwcos, 1.0 mM CaCl2 a 6.0 mM MgCl2. Addaswch i pH 7.4 a 310 i 330 mOsm). Trosglwyddwch y sleisys ymennydd a gafwyd i siambr sy'n cynnwys Ca2 + ACSF uwch (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, byffer sodiwm ffosffad 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glwcos, 4.0 mM CaCl2 a mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 a 310 i 320 mOsm). Storiwch y sleisys am 20 i 30 munud fel y gellir eu hadfer cyn recordio.
recordio. Defnyddiwyd llwyfan microsgop wedi'i gyfarparu â siambr recordio sefydlog a lens amcan trochi dŵr 20x (Scientifica) ar gyfer yr holl recordiadau. Nodwyd y celloedd Purkinje tybiedig yn ôl (i) maint y corff, (ii) lleoliad anatomegol y serebelwm, a (iii) mynegiant y genyn gohebydd fflwroleuol mtYFP. Mae'r piped clwt gyda gwrthiant blaen o 5 i 11 megohms yn cael ei dynnu allan gan gapilari gwydr borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, yr Almaen) a phibed llorweddol Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Perfformiwyd yr holl recordiadau gan fwyhadur clamp clwt ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, yr Almaen), a oedd yn cael ei reoli gan y feddalwedd Signal (fersiwn 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, DU). Recordiwyd yr arbrawf ar gyfradd samplu o 12.5 kHz. Mae'r signal yn cael ei hidlo gyda dau hidlydd Bessel pasio byr gydag amleddau torri o 1.3 a 10 kHz yn y drefn honno. Mae cynhwysedd y bilen a'r piped yn cael ei ddigolledu gan y gylched ddigolledu gan ddefnyddio'r mwyhadur. Perfformiwyd yr holl arbrawf o dan reolaeth camera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, yr Almaen), a oedd yn cael ei reoli gan feddalwedd Hokawo (fersiwn 2.8, Hamamatsu, Gerden, yr Almaen).
Ffurfweddu a dadansoddi celloedd cyfan arferol. Yn syth cyn cofnodi, llenwch y piped gyda'r toddiant mewnol sy'n cynnwys y sylweddau canlynol: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glwconad potasiwm, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosin triffosffad (GTP) (Na) a 10.0 mM creatinin ffosffad wedi'u haddasu i pH 7.25, ac roedd y pwysedd osmotig yn 290 mOsm (swcros). Yn syth ar ôl rhoi grym o 0 pA i rwygo'r bilen, mesurwyd potensial gorffwys y bilen. Mesurir y gwrthiant mewnbwn trwy roi ceryntau hyperbolaredig o -40, -30, -20, a -10 pA. Mesurwch faint yr ymateb foltedd a defnyddiwch gyfraith Ohm i gyfrifo'r gwrthiant mewnbwn. Cofnodwyd gweithgaredd digymell mewn clamp foltedd am 5 munud, ac adnabuwyd a mesurwyd sPSC yn Igor Pro (fersiwn 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, UDA) gan ddefnyddio sgript adnabod lled-awtomatig. Mesurir y gromlin IV a'r cerrynt cyflwr cyson trwy glampio'r batri ar wahanol botensialau (gan ddechrau o -110 mV) a chynyddu'r foltedd mewn camau o 5 mV. Profwyd cynhyrchiad AP trwy gymhwyso cerrynt dadbolaru. Clampiwch y gell ar -70 mV wrth gymhwyso pwls cerrynt dadbolaru. Addaswch faint cam pob uned recordio ar wahân (10 i 60 pA). Cyfrifwch yr amledd AP uchaf trwy gyfrif â llaw y pigau pwls sy'n achosi'r amledd AP uchaf. Dadansoddir y trothwy AP trwy ddefnyddio'r ail ddeilliad o'r pwls dadbolaru sy'n sbarduno un neu fwy o APs yn gyntaf.
Cyfluniad a dadansoddiad clwt tyllog. Perfformiwch recordiad clwt tyllog gan ddefnyddio protocolau safonol. Defnyddiwch bibed heb ATP a GTP nad yw'n cynnwys y cynhwysion canlynol: 128 mM glwconad K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA a 2 mM MgCl2, ac addaswch i pH 7.2 (gan ddefnyddio KOH). Mae ATP a GTP yn cael eu hepgor o'r toddiant mewngellol i atal athreiddedd afreolus y bilen gell. Mae'r bibed clwt wedi'i lenwi â thoddiant mewnol sy'n cynnwys amffotericin (tua 200 i 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) i gael cofnod clwt wedi'i dyrnu. Diddymwyd amffotericin mewn dimethyl sylffocsid (crynodiad terfynol: 0.1 i 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ni chafodd crynodiad y DMSO a ddefnyddiwyd unrhyw effaith sylweddol ar y niwronau a astudiwyd. Yn ystod y broses dyrnu, monitrwyd gwrthiant y sianel (Ra) yn barhaus, a dechreuwyd yr arbrawf ar ôl i osgled Ra ac AP sefydlogi (20-40 munud). Mesurir gweithgaredd digymell mewn clamp foltedd a/neu gerrynt am 2 i 5 munud. Perfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio Igor Pro (fersiwn 7.05.2, WaveMetrics, UDA), Excel (fersiwn 2010, Microsoft Corporation, Redmond, UDA) a GraphPad Prism (fersiwn 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Unol Daleithiau America). Er mwyn nodi APs digymell, defnyddir ategyn NeuroMatic v3.0c IgorPro. Nodwch APs yn awtomatig gan ddefnyddio trothwy penodol, sy'n cael ei addasu'n unigol ar gyfer pob cofnod. Gan ddefnyddio'r cyfnod pigyn, pennwch amledd y pigyn gyda'r amledd pigyn ar unwaith uchaf a'r amledd pigyn cyfartalog.
Ynysu PN. Drwy addasu i'r protocol a gyhoeddwyd yn flaenorol, cafodd PNs eu puro o serebelwm y llygoden ar gam penodol (58). Yn gryno, cafodd y serebelwm ei ddyrannu a'i falu mewn cyfrwng daduniad oerfel [heb HBSS Ca2+ a Mg2+, wedi'i ategu â 20 mM glwcos, penisilin (50 U/ml) a streptomycin (0.05 mg/ml)], ac yna treulio'r cyfrwng mewn papain [HBSS, wedi'i ategu ag 1-cystein·HCl (1 mg / ml), papain (16 U / ml) a deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Trin am 30 munud ar 30°C. Yn gyntaf, golchwch y meinweoedd mewn cyfrwng HBSS sy'n cynnwys mwcws wy (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) a DNase (0.1 mg/ml) ar dymheredd ystafell i atal treuliad ensymatig, ac yna yn y cyfrwng HBSS sy'n cynnwys 20 mM o glwcos. Gan falu'n ysgafn mewn HBSS, rhyddheir celloedd sengl gan benisilin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) a DNase (0.1 mg/ml). Hidlwyd yr ataliad celloedd canlyniadol trwy hidlydd celloedd 70μm, yna cafodd y celloedd eu pelenni trwy allgyrchu (1110 rpm, 5 munud, 4°C) a'u hail-atal mewn cyfrwng didoli [HBSS, wedi'i ategu â 20 mM o glwcos, 20% o serwm ffetws buchol, penisilin (50 U/ml) a streptomycin (0.05 mg/ml)]; gwerthuswch hyfywedd celloedd gydag ïodid propidiwm ac addaswch ddwysedd y celloedd i 1 × 106 i 2 × 106 celloedd/ml. Cyn cytometry llif, hidlwyd yr ataliad trwy hidlydd celloedd 50 μm.
Cytometr llif. Perfformiwyd didoli celloedd ar 4°C gan ddefnyddio peiriant FACSAria III (BD Biosciences) a meddalwedd FACSDiva (BD Biosciences, fersiwn 8.0.1). Didolwyd yr ataliad celloedd gan ddefnyddio ffroenell 100 μm o dan bwysau o 20 psi ar gyfradd o ~2800 digwyddiad/eiliad. Gan na all meini prawf giatio traddodiadol (maint celloedd, gwahaniaethu bimodal, a nodweddion gwasgaru) sicrhau ynysu PN yn gywir o fathau eraill o gelloedd, gosodir y strategaeth giatio yn seiliedig ar gymhariaeth uniongyrchol dwyster ac awto-fflworoleuedd YFP mewn llygod mitoYFP+ ​​a'r mitoYFP − rheoli. Cyffroir YFP trwy arbelydru'r sampl gyda llinell laser 488 nm, a chanfyddir y signal gan ddefnyddio hidlydd pasio band 530/30 nm. Mewn llygod mitoYFP+, defnyddir cryfder cymharol y genyn adroddwr Rosa26-mitoYFP hefyd i wahaniaethu rhwng darnau corff niwronau ac axon. Mae 7-AAD yn cael ei gyffroi gyda laser melyn 561 nm a'i ganfod gyda hidlydd bandpas 675/20 nm i eithrio celloedd marw. Er mwyn gwahanu astrocytau ar yr un pryd, cafodd yr ataliad celloedd ei staenio ag ACSA-2-APC, yna cafodd y sampl ei belydru â llinell laser 640 nm, a defnyddiwyd hidlydd bandpas 660/20 nm i ganfod y signal.
Cafodd y celloedd a gasglwyd eu pelenni drwy allgyrchu (1110 rpm, 5 munud, 4°C) a'u storio ar -80°C tan eu defnyddio. Caiff llygod Mfn2cKO a'u cŵn bach eu dosbarthu ar yr un diwrnod i leihau amrywioldeb gweithdrefnol. Perfformiwyd cyflwyniad a dadansoddiad data FACS gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, UDA).
Fel y soniwyd uchod (59), defnyddir PCR amser real i ynysu DNA o'r niwronau wedi'u didoli ar gyfer meintioli mtDNA wedi hynny. Profwyd y llinoledd a'r sensitifrwydd trothwy i ddechrau trwy redeg qPCR ar wahanol niferoedd o gelloedd. Yn fyr, casglwch 300 PN mewn byffer lysis sy'n cynnwys 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 a proteinase K (200 ng/ml) a'u magu ar 55°C am 120 munud. Magwyd y celloedd ymhellach ar 95°C am 10 munud i sicrhau bod proteinase K wedi'i ddadactifadu'n llwyr. Gan ddefnyddio stiliwr TaqMan (Thermo Fisher) sy'n benodol i mt-Nd1, mesurwyd mtDNA trwy PCR lled-feintiol yn y system PCR Amser Real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). y genynnau Science, rhif catalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, rhif catalog AIVI3E8) a 18S (Thermo Fisher Scientific, rhif catalog Hs99999901_s1).
Paratoi sampl proteom. Drwy gynhesu'r toddiant ar 95°C am 10 munud a'i sonio, yn y byffer lysis [6 M clorid guanidin, 10 mM tris(2-carboxyethyl) ffosffin hydroclorid, 10 mM cloroacetamid a 100 mM tris- Lyse pelenni niwron wedi'u rhewi mewn HCl]. Ar Bioruptor (Diagenode) am 10 munud (pwls 30 eiliad / cyfnod saib 30 eiliad). Cafodd y sampl ei wanhau 1:10 mewn 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ei gymysgu â 300 ng o aur trypsin (Promega), a'i ddeori dros nos ar 37°C i gyflawni treuliad cyflawn. Ar yr ail ddiwrnod, cafodd y sampl ei allgyrchu ar 20,000 g am 20 munud. Cafodd yr uwchnofiant ei wanhau â 0.1% asid fformig, a chafodd yr toddiant ei ddadhalenu gyda StageTips a wnaed eich hun. Sychwyd y sampl mewn offeryn SpeedVac (crynodiad Eppendorf ynghyd â 5305) ar 45°C, ac yna ataliwyd y peptid mewn asid fformig 0.1%. Paratowyd yr holl samplau ar yr un pryd gan yr un person. Er mwyn dadansoddi samplau astrocytau, labelwyd 4 μg o peptidau wedi'u dadhalenu gyda thag màs tandem (TMT10plex, rhif catalog 90110, Thermo Fisher Scientific) gyda chymhareb peptid i adweithydd TMT o 1:20. Ar gyfer labelu TMT, ail-ataliwyd 0.8 mg o adweithydd TMT mewn 70 μl o ACN anhydrus, ac ailgyfansoddwyd y peptid sych yn 9 μl o 0.1 M TEAB (bicarbonad triethylammonium), ac ychwanegwyd 7 μl o adweithydd TMT mewn ACN ato. Roedd y crynodiad yn 43.75%. Ar ôl 60 munud o ddeori, diffoddwyd yr adwaith gyda 2 μl o 5% hydroxylamin. Casglwyd y peptidau wedi'u labelu, eu sychu, eu hail-atal mewn 200μl o asid fformig (FA) 0.1%, eu rhannu'n ddau, ac yna eu dadhalenu gan ddefnyddio StageTips a wnaed gennych chi'ch hun. Gan ddefnyddio cromatograff hylif perfformiad uwch-uchel UltiMate 3000 (cromatograff hylif perfformiad uwch-uchel UltiMate 3000), cafodd un o'r ddwy hanner ei ffracsiynu ar golofn gromatograffig Acquity 1mm x 150mm wedi'i llenwi â gronynnau C18 130Å1.7μm (Waters, Rhif catalog SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Gwahanwch y peptidau ar gyfradd llif o 30μl/mun, gwahanwch o 1% i 50% o fwffer B am 85 munud gyda graddiant cam wrth gam o 96 munud, o 50% i 95% o fwffer B am 3 munud, yna 8 munud ar gyfer 95% o Fwffer B; Mae byffer A yn 5% ACN a 10 mM amoniwm bicarbonad (ABC), ac mae byffer B yn 80% ACN a 10 mM ABC. Casglwch ffracsiynau bob 3 munud a'u cyfuno'n ddau grŵp (1 + 17, 2 + 18, ac ati) a'u sychu mewn allgyrchydd gwactod.
Dadansoddiad LC-MS/MS. Ar gyfer sbectrometreg màs, gwahanwyd y peptidau (rhif r119.aq) ar golofn ddadansoddol PicoFrit 25 cm, 75 μm o ddiamedr mewnol (lens amcan newydd, rhif rhan PF7508250) wedi'i chyfarparu â chyfrwng ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), Defnyddiwch EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, yr Almaen). Cadwyd y golofn ar 50°C. Mae byfferau A a B yn 0.1% asid fformig mewn dŵr a 0.1% asid fformig mewn 80% ACN, yn y drefn honno. Gwahanwyd peptidau o 6% i 31% o fyffer B am 65 munud ac o 31% i 50% o fyffer B am 5 munud gyda graddiant o 200 nl/mun. Dadansoddwyd y peptidau wedi'u helutio ar sbectromedr màs Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Perfformir mesuriad m/z rhagflaenydd peptid gyda datrysiad o 120,000 yn yr ystod o 350 i 1500 m/z. Gan ddefnyddio 27% o egni gwrthdrawiad wedi'i normaleiddio, dewisir y rhagflaenydd cryfaf gyda chyflwr gwefr o 2 i 6 ar gyfer hollti daduniad trap C egni uchel (HCD). Mae'r amser cylch wedi'i osod i 1 eiliad. Mesurwyd gwerth m/z y darn peptid yn y trap ïon gan ddefnyddio'r targed AGC lleiaf o 5 × 104 a'r amser chwistrellu mwyaf o 86 ms. Ar ôl darnio, gosodwyd y rhagflaenydd ar y rhestr gwahardd ddeinamig am 45 eiliad. Gwahanwyd peptidau wedi'u labelu â TMT ar golofn Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, rhif catalog 164942), a dadansoddwyd y sbectrwm mudo ar sbectromedr màs Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) sydd â chyfarpar ïonau tonffurf anghymesur maes uchel (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) sy'n gweithredu ar ddau foltedd iawndal o −50 a −70 V. Defnyddir MS3 a ddewiswyd yn seiliedig ar y rhagflaenydd cydamseru ar gyfer mesur signal ïon adroddiad TMT. Cynhaliwyd y gwahanu peptid ar EASY-nLC 1200, gan ddefnyddio elution graddiant llinol 90%, gyda chrynodiad byffer o 6% i 31%; roedd byffer A yn 0.1% FA, a byffer B yn 0.1% FA ac 80% ACN. Mae'r golofn ddadansoddol yn cael ei gweithredu ar 50°C. Defnyddiwch FreeStyle (fersiwn 1.6, Thermo Fisher Scientific) i rannu'r ffeil wreiddiol yn ôl y foltedd iawndal FAIMS.
Adnabod a meintioli proteinau. Gan ddefnyddio'r peiriant chwilio integredig Andromeda, dadansoddwyd y data gwreiddiol gan ddefnyddio MaxQuant fersiwn 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Yn ogystal â'r dilyniannau Cre recombinase ac YFP a gafwyd o Aequorea victoria, chwiliwyd sbectrwm darn peptid am y dilyniant canonaidd a dilyniant isoform y proteome cyfeirio llygoden (Proteome ID UP000000589, wedi'i lawrlwytho o UniProt ym mis Mai 2017). Gosodwyd ocsidiad methionin ac asetyliad N-derfynol protein fel addasiadau amrywiol; gosodwyd methyliad carbamoyl cystein fel addasiadau sefydlog. Mae'r paramedrau treulio wedi'u gosod i "benodolrwydd" a "trypsin/P". Y nifer lleiaf o beptidau a pheptidau rasel a ddefnyddir ar gyfer adnabod proteinau yw 1; y nifer lleiaf o beptidau unigryw yw 0. O dan amodau paru map peptid, y gyfradd adnabod protein oedd 0.01. Mae'r opsiwn "Ail Beptid" wedi'i alluogi. Defnyddiwch yr opsiwn "cyfateb rhwng rhediadau" i drosglwyddo adnabyddiaethau llwyddiannus rhwng gwahanol ffeiliau gwreiddiol. Defnyddiwch gyfrif cymhareb lleiaf LFQ 1 ar gyfer meintioli di-label (LFQ) (60). Mae dwyster LFQ yn cael ei hidlo ar gyfer o leiaf ddau werth dilys mewn o leiaf un grŵp genoteip ar bob pwynt amser, ac mae'n cael ei allosod o ddosraniad arferol gyda lled o .0.3 a symud i lawr 1.8. Defnyddiwch blatfform cyfrifiadura Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ac R (https://r-project.org/) i ddadansoddi canlyniadau LFQ. Defnyddiwyd prawf t cymedrol dwy ffordd o'r pecyn meddalwedd limma ar gyfer dadansoddi mynegiant gwahaniaethol (61). Perfformir dadansoddiad data archwiliadol gan ddefnyddio ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally a pheatmap. Dadansoddwyd y data proteomeg yn seiliedig ar TMT gan ddefnyddio MaxQuant fersiwn 1.6.10.43. Chwiliwch am ddata proteomeg crai o gronfa ddata proteomeg ddynol UniProt, a lawrlwythwyd ym mis Medi 2018. Mae'r dadansoddiad yn cynnwys y ffactor cywiro purdeb isotop a ddarparwyd gan y gwneuthurwr. Defnyddiwch limma yn R ar gyfer dadansoddi mynegiant gwahaniaethol. Mae'r data gwreiddiol, canlyniadau chwilio'r gronfa ddata, a llif gwaith a chanlyniadau dadansoddi data i gyd wedi'u storio yng nghynghrair ProteomeXchange trwy ystorfa bartner PRIDE gyda'r dynodwr set ddata PXD019690.
Mae anodiadau swyddogaethol yn cyfoethogi'r dadansoddiad. Defnyddiwyd yr offeryn Dadansoddi Llwybr Dyfeisgarwch (QIAGEN) i bennu cyfoethogrwydd termau anodiad swyddogaethol y set ddata ar ôl 8 wythnos (Ffigur 1). Yn gryno, defnyddir y rhestr protein meintiol a gafwyd o ddadansoddiad data LC-MS/MS (sbectrometreg màs tandem) gyda'r meini prawf hidlo canlynol: Dewisir Mus musculus fel y rhywogaeth a'r cefndir, ac mae'r categori yn dangos bod y gwerth P wedi'i addasu gan Benjamini ar gyfer cyfoethogi 0.05 neu is yn cael ei ystyried yn arwyddocaol. Ar gyfer y graff hwn, dangosir y pum categori gormodol uchaf ym mhob clwstwr yn seiliedig ar y gwerth P wedi'i addasu. Gan ddefnyddio prawf-t lluosog, gan ddefnyddio rhaglen hwb llinol dau gam Benjamini, Krieger, a Yekutieli (Q = 5%), perfformir dadansoddiad mynegiant protein cwrs amser ar yr ymgeiswyr pwysig a nodwyd ym mhob categori, a dadansoddir pob rhes ar wahân. Nid oes angen mabwysiadu SD cyson.
Er mwyn cymharu canlyniadau'r astudiaeth hon â chronfeydd data cyhoeddedig a chynhyrchu diagram Venn yn Ffigur 1, fe wnaethom gyfuno'r rhestr protein meintiol ag anodiadau MitoCarta 2.0 (24). Defnyddiwch yr offeryn ar-lein Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) i gynhyrchu'r diagram.
Am wybodaeth fanwl am y gweithdrefnau ystadegol a ddefnyddir ar gyfer dadansoddi proteomeg, cyfeiriwch at yr adran gyfatebol o Ddeunyddiau a Dulliau. Ar gyfer pob arbrawf arall, gellir dod o hyd i wybodaeth fanwl yn y chwedl gyfatebol. Oni nodir yn wahanol, mynegir yr holl ddata fel cymedr ± SEM, a pherfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 8.1.2.
Am ddeunyddiau atodol ar gyfer yr erthygl hon, gweler http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Mae hon yn erthygl mynediad agored a ddosberthir o dan delerau'r Drwydded Creative Commons Attribution-Non-Commercial, sy'n caniatáu'r defnydd, y dosbarthiad a'r atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng, cyn belled nad yw'r defnydd terfynol at elw masnachol a'r rhagdybiaeth yw bod y gwaith gwreiddiol yn gywir. Cyfeirnod.
Nodyn: Dim ond gofynnwn i chi ddarparu eich cyfeiriad e-bost fel bod y person rydych chi'n ei argymell i'r dudalen yn gwybod eich bod chi eisiau iddyn nhw weld yr e-bost ac nad sbam ydyw. Ni fyddwn yn casglu unrhyw gyfeiriadau e-bost.
Defnyddir y cwestiwn hwn i brofi a ydych chi'n ymwelydd ac atal cyflwyno sbam yn awtomatig.
Gan E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Datgelodd dadansoddiad proteomeg o niwronau camweithredol fod rhaglenni metabolaidd yn cael eu actifadu i wrthweithio niwroddirywiad.
Gan E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Datgelodd dadansoddiad proteomeg o niwronau camweithredol fod rhaglenni metabolaidd yn cael eu actifadu i wrthweithio niwroddirywiad.
©2020 Cymdeithas America er Hyrwyddo Gwyddoniaeth. cedwir pob hawl. Mae AAAS yn bartner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. GwyddoniaethAdvances ISSN 2375-2548.