Cyfeiriad presennol†Cyfeiriad presennol: OX11 0DE, DU, Adeilad Diamond, Parc Gwyddoniaeth ac Arloesi Harwell, Dietcote, Swydd Rydychen, DU, Diamond Light Source Co., Ltd., Canolfan Delweddu Biolegol Electronig.
Cymhleth cynaeafu golau canolfan adwaith 1 (RC-LH1) yw'r gydran ffotosynthetig graidd o facteria ffototroffig porffor. Cyflwynwyd dau strwythur microsgopeg cryo-electron o'r cymhleth RC-LH1 o Rhodopseudomonas palustris. Mae strwythur cydraniad 2.65-Å y cymhleth RC-LH114-W yn cynnwys 14 dolen LH1 is-uned sy'n amgylchynu RC, sy'n cael ei dorri gan brotein W, tra bod y cymhleth heb brotein-W wedi'i amgylchynu'n llwyr gan RC. Dolen LH1 16 is-uned gaeedig. Mae'r gymhariaeth o'r strwythurau hyn yn rhoi cipolwg ar ddeinameg cwinon yn y cymhleth RC-LH1, gan gynnwys newidiadau cyfluniadol nas pennwyd o'r blaen wrth rwymo cwinon yn safle QB RC, yn ogystal â lleoliad safleoedd rhwymo cwinon ategol, sy'n helpu i'w trosglwyddo i RC. Mae strwythur unigryw'r protein W yn atal cau'r ddolen LH1, a thrwy hynny'n creu sianel ar gyfer cyflymu'r cyfnewid cwinon/cwinolon.
Gall yr ynni a ddarperir gan ffotosynthesis gynnal bron pob bywyd ar y ddaear, ac mae ganddo botensial mawr ar gyfer biodechnoleg solar. Wrth hyrwyddo ffotosynthesis byd-eang, mae bacteria ffototroffig porffor hefyd yn arddangos amrywiol ddulliau ynni a galluoedd metabolaidd. Gallant osgoi ffotosynthesis a thyfu fel bacteria heterotroffig yn y tywyllwch, gallant drwsio nitrogen a charbon deuocsid, cynhyrchu hydrogen, a diraddio cyfansoddion aromatig (1-3). Er mwyn darparu ynni ar gyfer y prosesau hyn, rhaid trosi golau yn gyflym ac yn effeithlon yn ynni cemegol. Mae'r broses hon yn dechrau pan fydd y cymhlyg antena sy'n dal golau yn amsugno golau ac yn trosglwyddo'r ynni sydd wedi'i ddal i'r ganolfan adwaith (RC), gan ddechrau gwahanu gwefr (4-7). Mae uned sylfaenol ffotosynthesis mewn bacteria ffototroffig porffor yn cynnwys RC math 2, wedi'i amgylchynu gan gymhlyg cynaeafu golau 1 (LH1), gan ffurfio'r cymhlyg craidd RC-LH1. Mae LH1 yn cael ei ffurfio gan arae o heterodimerau αβ crwm, pob un ohonynt yn rhwymo dau foleciwl cloroffyl bacteriol (BChl) a ac un neu ddau garotenoid (8-12). Mae'r antena LH1 symlaf yn cynnwys 16 neu 17 heterodimerig αβ sy'n amgylchynu RC (9-13) mewn dolen gaeedig, ond mewn cyfadeiladau craidd eraill, mae peptidau trawsbilen yn torri ar draws parhad yr LH1 o'i gwmpas, gan hyrwyddo'r trylediad cwinol/cwinon rhwng RC a chyfadeilad cytochrome bc1 (11, 13-15). Mae'r planhigyn ffototroffig porffor Rhodopseudomonas (Rps.) yn organeb fodel a all ddeall y trosglwyddiad ynni ac electronau sy'n cefnogi ffotosynthesis. Strwythur crisial cyntaf Rps. Model y cyfadeilad palustris RC-LH1 yw RC, wedi'i amgylchynu gan 15 dolen LH1 heterodimerig, sy'n cael eu torri ar draws gan brotein anhysbys o'r enw "Protein W" (14). Nodwyd Protein-W wedi hynny fel RPA4402, sef protein 10.5kDa heb ei nodweddu gyda thri helices trawsbilen rhagfynegedig (TMH) (16). Rydym yn cynnig ailenwi'r genyn rpa4402 sy'n amgodio protein W i pufW i fod yn gyson â'r enwau a ddefnyddir ar gyfer genynnau sy'n amgodio is-unedau RC-L, M (pufL, pufM) ac LH1α, β (pufA, pufB). Yn ddiddorol, dim ond mewn tua 10% o RC-LH1 y mae protein-W yn bresennol, gan ddatgelu bod Rps. palustris yn cynhyrchu dau gymhlyg RC-LH1 gwahanol. Yma, rydym yn adrodd ar strwythurau cryo-EM cydraniad uchel (cryo-EM) dau gymhlyg craidd, un gyda phrotein W a 14 heterodimer αβ, y llall heb brotein W a dolen LH1 16 Heterodimer caeedig. Mae ein strwythur yn cynrychioli newid sylweddol yn y ddealltwriaeth o gymhlyg RC-LH1 Rps. palustris, oherwydd ein bod wedi dadansoddi'r boblogaeth homogenaidd o bob amrywiad ac mae gennym ddigon o gydraniad i aseinio pob peptid a pigmentau rhwym a lipidau a chwinonau cysylltiedig yn glir. Mae'r gymhariaeth o'r strwythurau hyn yn dangos bod y tri phrotein TMH-W nad ydynt wedi'u canfod mewn unrhyw gymhlyg RC-LH1 arall hyd yn hyn yn cynhyrchu sianel cwinon i gyflymu'r cyfnewid cwinon/cwinolon. Mae nifer o safleoedd rhwymo lipid a chwinon cadwedig wedi'u nodi, ac rydym wedi datgelu newid cyfluniadol newydd ar ôl cyfuniad cwinon ac RC, a allai fod yn addas ar gyfer RC ffotosystem II (PSII) organebau ffototroffig ocsigenedig. Mae ein canfyddiadau'n rhoi cipolwg newydd ar gineteg rhwymo a chyfnewid cwinon/cwinolon yng nghyfhlyg craidd RC-LH1 bacteria ffototroffig porffor.
Er mwyn hwyluso astudiaeth fanwl o'r ddau gymhlyg a geir yn Rps. palustris, rydym yn ynysu pob RC-LH1 trwy ddulliau biocemegol. Cafodd y cymhlyg diffygiol o ran protein W (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel ΔpufW) ei buro o'r straen sy'n brin o'r genyn pufW (16), a dim ond un cymhlyg RC-LH1 y gellir ei gynhyrchu. Cynhyrchir y cymhlyg sy'n cynnwys protein W gan straen. Mae protein W y straen hwn wedi'i addasu gyda thag 10x His yn ei derfyn C, fel y gellir cyfuno'r cymhlyg sy'n cynnwys protein W yn effeithiol â'r rhan fwyaf o brotein W sy'n brin trwy atal metel rhag symud. Mae'r cymhlyg wedi'i wahanu'n effeithiol (16) Cromatograffeg Affinedd (IMAC).
Fel y dangosir yn Ffigur 1, mae'r ddau gymhlyg yn cynnwys RC tair is-uned (RC-L, RC-M ac RC-H) wedi'i amgylchynu gan antena LH1. Mae strwythur 2.80-A y cymhlyg sy'n brin o brotein-W yn dangos 16 heterodimer αβ, gan ffurfio dolen LH1 gaeedig sy'n amgylchynu RC yn llwyr, a elwir o hyn ymlaen yn gymhlyg RC-LH116. Mae gan strwythur 2.65Å y cymhlyg sy'n cynnwys protein-W 14-heterodimer LH1 wedi'i dorri gan brotein-W, a elwir o hyn ymlaen yn RC-LH114-W.
(A a B) Cynrychiolaeth arwyneb y cyfansoddyn. (C a D) Pigmentau wedi'u bondio wedi'u mynegi mewn rhodenni. (E ac F) Mae gan y cymhlygion a welir o'r wyneb cytoplasmig y peptidau ac is-unedau LH1 a gynrychiolir mewn cartwnau, ac maent wedi'u rhifo'n glocwedd o'r bwlch protein-W [yn gyson â rhifo Rba. cymhlyg sphaeroides (13)]. Ar gyfer LH1-α, lliw'r is-uned protein yw melyn; ar gyfer LH1-β, lliw'r is-uned protein yw glas; ar gyfer protein-W, mae'r protein yn goch; ar gyfer RC-H, mae'n wyrddlas; ar gyfer RC-L, mae'n Oren; ar gyfer RC-M, magenta. Cynrychiolir cyd-ffactorau gan rhodenni, mae gwyrdd yn cynrychioli moleciwlau BChl a BPh a, mae porffor yn cynrychioli carotenoidau, ac mae melyn yn cynrychioli moleciwlau UQ10. (G a H) Golygfa chwyddedig o'r bwlch protein-W yn rhanbarth cyfatebol cymhlyg RC-LH114-W (G) a chymhlyg RC-LH116 (H). Dangosir cyd-ffactorau ar ffurf llenwi gofod, dangosir cwinon chelated mewn glas. Mae'r bwlch protein-W wedi'i amlygu gan linell doredig las yn (G), ac mae'r tyllau bach lle mae cwinon/cwinolol yn tryledu ar y cylch LH116 wedi'u hamlygu gan linell doredig ddu yn (H).
Mae Ffigur 1 (A a B) yn dangos yr RC wedi'i amgylchynu gan araeau agored neu gaeedig o heterodimerau LH1αβ, pob un ohonynt yn rhwymo dau BChl ac un carotenoid (Ffigur 1, C a D). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos mai Rps yw'r cymhlyg LH1. Yn llwybr biosynthetig xanthin spirulina, mae'r rhywogaethau hyn yn cynnwys poblogaethau cymysg o garotenoidau (17). Fodd bynnag, spiropyrroxanthin yw'r carotenoid mwyaf amlwg ac mae ei ddwysedd yn foddhaol. Felly, dewiswyd modelu spiroxanthin ym mhob safle rhwymo LH1. Mae'r polypeptidau alffa a beta yn TMHs sengl gyda rhanbarthau allanol pilen byr (Ffigur 1, A, B, E, ac F). Er na welwyd dwysedd 17 o weddillion yn y derfynfa C, holltwyd y polypeptid alffa o Met1 i Ala46 yn y ddau gymhlyg. Gostyngwyd polypeptid β o Gly4 i Tyr52 yn RC-LH116, ac o Ser5 i Tyr52 yn RC-LH114-W. Ni welwyd dwysedd o 3 neu 4 gweddillion N-derfynol na 13 gweddillion C-derfynol (Ffigur S1). Dangosodd dadansoddiad sbectrometreg màs o'r cymhlyg RC-LH1 cymysg a baratowyd o'r straen gwyllt mai canlyniad hollti heterologaidd y peptidau hyn oedd y rhanbarth coll (Ffigur S1 ac S2). Gwelwyd ffurfiant N-derfynol α-Met1 hefyd (f). Dangosodd y dadansoddiad fod yr α-peptid yn cynnwys gweddillion fMet1 i Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, a bod y β-peptid yn cynnwys gweddillion Ser2 i Ala53, sy'n cytuno'n dda â'r map dwysedd EM tymheredd isel.
Mae cydlyniad α-His29 a β-His36 yn gwneud BChls wyneb yn wyneb; mae pob heterodimer αβ yn ymgynnull gyda'i gymdogion i ffurfio dolen agored (RC-LH114-W) neu ddolen gaeedig (RC-LH116) o amgylch yr RC. Y râi pigment cyplu exciton (Ffigur 1, C a D). O'i gymharu â band 877 nm RC-LH114-W, mae'r sifftiad coch amsugno 880 nm o RC-LH116 yn 3 nm (Ffigur 2A). Fodd bynnag, mae'r sbectrwm dichroism cylchol bron yr un fath (Ffigur 2B), sy'n dangos, er bod gwahaniaeth clir rhwng dolenni agored a chaeedig, bod amgylchedd lleol BChls yn debyg iawn. Gall y sifftiad coch amsugno fod yn ganlyniad i symudiad thermol llai a sefydlogrwydd cynyddol ar y ddolen gaeedig (18, 19), y newid mewn cyplu pigment a achosir gan y ddolen gaeedig (20, 21), neu gyfuniad o'r ddau effaith hyn (11).
(A) Sbectrwm amsugno uwchfioled/gweladwy/agos-is-goch, y mae ei gopaon wedi'u marcio â'u pigmentau cyfatebol ac wedi'u normaleiddio i gopa BPh ar 775 nm. (B) Sbectrwm dichroism cylchol wedi'i normaleiddio i amsugnedd BChl ar 805 nm. (C a D) Sbectrwm ΔA wedi'i ddewis o'r sbectrwm amsugno amser-datrysedig o gymhlyg RC-LH114-W (C) a chymhlyg RC-LH116 (D). Er mwyn cymharu'n well, mae'r holl sbectrwm wedi'i normaleiddio i ∆A o −A ar 0.2 ps. (E) Cyfradd ocsideiddio cytochrome c2 ar ôl arbelydru ym mhresenoldeb gwahanol grynodiadau o UQ2 (gweler Ffigur S8 am ddata crai). (F) Mewn celloedd a dyfir o dan olau dwyster isel, canolig neu uchel (10, 30 neu 300μMm-2 s-1, yn y drefn honno), is-unedau protein W ac RC-L yn y cymhlyg wedi'i buro a'r gymhareb bilen wedi'i gwahanu. Pennwch lefel y protein drwy electrofforesis gel SDS-polyacrylamid ac imiwnoasai (gweler Ffigur S9 am ddata crai). Pennwch y gymhareb o'i gymharu â'r cymhlyg RC-LH114-W wedi'i buro. Cymhareb stoichiometrig RC-L i brotein-W y cymhlyg yw 1:1.
Mae'r BChls yn safle 1 yn y ddolen αβ14 anffurfiedig o RC-LH114-W (Ffigur 1, A, C, ac E) yn agosach at y rhoddwr cynradd RC (P) o 6.8Å na'r BChls cyfatebol yn RC-LH116 (Ffigur 1, B, D, ac F, a Ffigur S3); fodd bynnag, mae cineteg amsugno dros dro'r ddau gymhlyg yn dangos, ar gyfer RC-LH114-W ac RC-LH116, bod y cysonion amser trosglwyddo egni cyffroi o LH1 i RC yn 40 ±4 a 44 ±3 ps (Ffigur 2). , C a D, Ffigur S4 a Thabl S2). Nid oes unrhyw wahaniaeth sylweddol mewn trosglwyddiad electronig o fewn RC chwaith (Ffigur S5 a thestun atodol cysylltiedig). Rydym yn amau ​​bod y gyfatebiaeth agos o'r amser trosglwyddo egni rhwng LH1 ac RC-P oherwydd y pellter, yr ongl a'r egni potensial tebyg o'r rhan fwyaf o BChl yn y ddwy ddolen LH1. Ymddengys nad yw archwilio patrwm ynni LH1 i gyrraedd y pellter lleiaf yn gyflymach na throsglwyddo ynni uniongyrchol o safleoedd is-optimaidd i RC. Gall y ddolen LH1 agored yn RC-LH114-W hefyd gael symudiad thermol dibwys o dan amodau tymheredd isel ar gyfer dadansoddi strwythurol, ac mae cyfluniad cylch αβ14 hirach ar dymheredd ystafell o bellter pigmentiad βBChls yn safle RC 1.
Mae'r cymhlyg RC-LH116 yn cynnwys 32 BChl a 16 carotenoid, ac mae ei drefniant cyffredinol yr un fath â'r hyn a gafwyd o Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 straen (PDB ID 7C9R) (12) ac algâu gwyrdd (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Ar ôl alinio, dim ond gwyriadau bach a welwyd yn safleoedd heterodimerau αβ, yn enwedig 1-5, 15, a 16 (Ffigur S6). Mae presenoldeb protein-W yn cael effaith sylweddol ar strwythur LH1. Mae ei dri TMH wedi'u cysylltu gan ddolenni byr, gyda'r derfynfa N ar ochr lumen y cymhlyg a'r derfynfa C ar yr ochr cytoplasmig (Ffigurau 1A a 3, A i D). Mae Protein-W yn hydroffobig i raddau helaeth (Ffigur 3B), ac mae TMH2 a TMH3 yn rhyngweithio ag LH1αβ-14 i ffurfio arwyneb trawsbilen (Ffigur 3, B ac E i G). Mae'r rhyngwyneb yn cynnwys gweddillion Phe, Leu a Val yn bennaf yn y rhanbarth trawsbilen. Mae'r gweddillion hyn wedi'u pentyrru ag asidau amino hydroffobig a pigmentau αβ-14. Mae rhai gweddillion pegynol hefyd yn cyfrannu at y rhyngweithio, gan gynnwys y bond hydrogen rhwng W-Thr68 a β-Trp42 ar wyneb y ceudod cymhleth (Ffigur 3, F a G). Ar wyneb y cytoplasm, mae Gln34 wrth ymyl y grŵp ceto o garotenoidau αβ-14. Yn ogystal, cafodd y moleciwl n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ei ddatrys, ac ymestynnodd ei gynffon hydroffobig i'r rhyngwyneb rhwng protein-W ac αβ-14, a gall y gynffon lipid fod wedi'i lleoli yn y corff. Fe wnaethon ni hefyd sylwi bod rhanbarthau datrys C-derfynol protein W ac RCH yn agos iawn, ond nid o fewn cwmpas ffurfio rhyngweithiadau penodol (Ffigur 1, A ac E). Fodd bynnag, efallai y bydd rhyngweithiadau yn asidau amino C-derfynol heb eu datrys y ddau brotein hyn, a all ddarparu mecanwaith ar gyfer recriwtio protein-W yn ystod cydosod y cymhlyg RC-LH114-W.
(A) Mae gan Protein-W, sy'n wynebu'r rhyngwyneb ag LH1αβ14 ar ffurf cartŵn, gadwyn ochr siâp gwialen (coch), a ddangosir mewn rhan o'r diagram potensial electrostatig (arwyneb llwyd tryloyw gyda lefel cyfuchlin o 0.13). (B) Protein-W a gynrychiolir gan arwyneb lliw hydroffobig. Dangosir ardaloedd pegynol a gwefredig mewn cyan, dangosir ardaloedd hydroffobig mewn gwyn, ac arddangosir ardaloedd hydroffobig cryf mewn oren. (C a D) Protein-W a gynrychiolir yn y cartŵn, mae ei gyfeiriadedd yr un fath ag yn (A) (C), ac wedi'i gylchdroi 180° (D). Yn ôl y safle yn y dilyniant, mae'r gweddillion gwahaniaethol yn mabwysiadu cynllun lliw enfys, lle mae'r derfynfa N yn las a'r derfynfa C yn goch. (E) Protein-W yn yr un olygfa ag yn (A), a chynrychiolir y gweddillion ar ryngwyneb protein-W:LH1 gan wiail gyda marciau ynghlwm. (F) Mae Protein-W wedi'i gylchdroi 90° o'i gymharu â (E) ac LH1αβ14 yn y cynrychiolaeth cartŵn, ac o'i gymharu â'r gweddillion rhyngwyneb yn y cynrychiolaeth bar. Mae'r gweddillion sy'n hongian drosodd o'r polypeptid beta wedi'u labelu. Dangosir y cyd-ffactor fel bar sy'n cyfateb i liw Ffigur 1, dangosir y β-DDM wedi'i ddadelfennu mewn llwyd, a dangosir yr ocsigen mewn coch. (G) Mae'r olygfa yn (F) wedi'i gylchdroi 180°, gyda gweddillion amlwg y polypeptid alffa wedi'i labelu.
Mae Protein-W yn disodli heterodimer αβ (y 15fed yn Ffigur 1F), a thrwy hynny'n atal cau dolen a gogwyddo'r tri heterodimer αβ cyntaf. Gwelwyd bod ongl gogwydd uchaf yr heterodimer αβ-1 cyntaf o'i gymharu â normal y ffilm yn 25° i 29° (Ffigur 1, A ac E), a ffurfiwyd gan y gogwydd 2° i 8° o αβ-1 yn RC A sharp contrast-LH116 (Ffigur 1, B ac F). Mae'r ail a'r trydydd heterodimer wedi'u gogwyddo ar 12° i 22° a 5° i 10°, yn y drefn honno. Oherwydd rhwystr sterig RC, nid yw gogwydd αβ-1 yn cynnwys yr ail bâr o αβ (sy'n cyfateb i'r 16eg αβ yn Ffigur 1F), gan ffurfio bwlch clir yn y cylch LH1 (Ffigur 1, A ac E). Oherwydd diffyg dau heterodimer αβ, ynghyd â cholli pedwar BChl a dau garotenoid, nid yw'r un o'r carotenoidau'n rhwymo i'r is-uned αβ-1 dirdro, gan arwain at gylch LH114-W sy'n cynnwys 13 carotenoid Llysieuol a 28 BChl. Mae'r amcangyfrifon datrysiad lleol o'r ddau gymhlyg yn y rhanbarthau αβ1 i 7 yn is na rhai gweddill y ddolen LH1, a all adlewyrchu plastigedd cynhenid ​​​​is-uned LH1 gerllaw safle RC QB (Ffigur 4).
Dangosir y lluniau o RC-LH114-W (A a B) ac RC-LH116 (C a D) o'r un olygfa uchaf/ochr (A a B) (A a C) ac arwyneb ceudod Ffig. 1. (B a D). Dangosir yr allweddi lliw ar y dde.
Yr unig gymhleth craidd nodweddiadol arall gyda chymhareb stoichometrig o 1:14 yw'r dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Fodd bynnag, nid oes gan brotein W a PufX homologi amlwg, ac mae ganddynt effaith sylweddol ar eu strwythurau LH1 priodol. Mae PufX yn TMH sengl gyda pharth cytoplasmig N-derfynol sy'n rhyngweithio ag ochr cytoplasmig yr is-uned RC-H (13) mewn safle sy'n cyfateb i Rps. palustris LH116αβ-16. Mae PufX yn creu sianel ar gyfer y cyfnewid cwinon/cwinolon rhwng RC-LH1 a'r cymhlyg cytochrome bcl ac mae'n bresennol ym mhob cymhlyg craidd Rba. sphaeroides (13). Er bod y rhyngwyneb monomer-monomer yn Rba. Mae'r dimer sphaeroides RC-LH1-PufX wedi'i leoli yn safle rhwymo protein W yn RC-LH114-W, ac mae'r bwlch a achosir gan PufX a phrotein-W mewn safle cyfatebol (Ffigur S7A). Mae'r bwlch yn RC-LH114-W hefyd wedi'i alinio â sianel quinone ddamcaniaethol (8) Pseudomonas rosea LH1, sy'n cael ei ffurfio gan beptidau nad ydynt yn gysylltiedig â phrotein W na PufX (Ffigur S7B). Yn ogystal, mae'r sianel quinone yn Blc. Mae'r LH1 gwyrdd emrallt a ffurfiwyd trwy eithrio un is-uned γ (7) wedi'i leoli mewn safle tebyg (Ffigur S7C). Er ei fod wedi'i gyfryngu gan wahanol broteinau, mae ymddangosiad y sianeli quinone/quinolol hyn mewn safle cyffredin yn y cymhlyg RC-LH1 yn ymddangos yn enghraifft o esblygiad cydgyfeiriol, sy'n dangos y gallai'r bwlch a grëwyd gan brotein W weithredu fel sianel quinone.
Mae'r bwlch yn y ddolen LH114-W yn caniatáu ffurfio rhanbarth pilen barhaus rhwng gofod mewnol y cymhlyg RC-LH114-W a'r bilen swmp (Ffigur 1G), yn hytrach na chysylltu'r ddau barth trwy mandwll protein fel mewn proteinau. Mae'r cymhlyg RC-LH116 yn debyg i gymhlyg Tch. caeedig tebyg i nodwydd (22) (Ffigur 1H). Gan fod trylediad cwinon trwy'r bilen yn gyflymach na'r trylediad trwy'r sianel protein gul, gall y ddolen LH114-W agored ganiatáu trosiant RC cyflymach na'r ddolen LH116 gaeedig, a gall trylediad cwinon i'r RC fod yn fwy cyfyngedig. Er mwyn profi a yw protein W yn effeithio ar drawsnewid cwinonau trwy RC, fe wnaethom gynnal assay ocsideiddio cytocrom ar grynodiad penodol o ubiquinone 2 (UQ2) (analog o UQ10 naturiol gyda chynffon isopren fyrrach) (Ffigur 2E). Er bod presenoldeb cwinon chelated yn rhwystro pennu cywir y cysonyn Michaelis ymddangosiadol (mae RC-LH114-W ac RC-LH116 yn addas ar gyfer 0.2±0.1μM a 0.5±0.2μM, yn y drefn honno), mae cyfradd uchaf RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% yn fwy na RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Amcangyfrifon ni i ddechrau bod protein-W yn bresennol mewn tua 10% o'r cymhlyg craidd (16); yma, mae cyfraddau meddiannaeth celloedd twf golau isel, golau canolig, a golau uchel yn 15±0.6%, 11±1% a 0.9±0.5, yn y drefn honno % (Ffigur 2F). Dangosodd cymhariaeth feintiol o sbectrometreg màs nad oedd ychwanegu tag histidin yn lleihau helaethrwydd cymharol protein-W o'i gymharu â straenau gwyllt (P = 0.59), felly nid yw'r lefelau hyn yn arteffact o brotein-W wedi'i addasu (Ffigur S10). Fodd bynnag, gall y meddiannaeth isel hon o brotein-W yn y cymhlyg RC-LH1 ganiatáu i rai RCs fflipio ar gyfradd gyflymach, a thrwy hynny liniaru'r cyfnewid cwinon/cwinolon arafach yn y cymhlyg RC-LH116. Sylwon ni fod y gyfradd meddiannaeth golau uchel yn anghyson â'r data trawsgrifiadomeg diweddar, sy'n dangos bod mynegiant genyn pufW yn cynyddu o dan olau cryf (Ffigur S11) (23). Mae'r gwahaniaeth rhwng trawsgrifio pufW ac ymgorffori protein-W yn y cymhlyg RC-LH1 yn ddryslyd a gall adlewyrchu rheoleiddio cymhleth y protein.
Yn RC-LH114-W, mae 6 cardiolipin (CDL), 7 ffosffatidylcholin (POPC), 1 ffosffatidylglycerol (POPG) a 29 moleciwl β-DDM wedi'u dyrannu a'u modelu ynddo 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG a 12 βDDM. RC-LH116 (Ffigur 5, A a B). Yn y ddau strwythur hyn, mae CDL bron wedi'i leoli ar ochr cytoplasmig y cymhlyg, tra bod POPC, POPG a β-DDM wedi'u lleoli'n bennaf ar yr ochr luminal. Ynysigwyd dau foleciwl lipid a glanedydd yn rhanbarth αβ-1 i αβ-6 y cymhlyg RC-LH114-W (Ffigur 5A), ac ynysigwyd pump yn rhanbarth cyfatebol RC-LH116 (Ffigur 5B). Canfuwyd mwy o lipidau ar ochr arall y cymhlyg, yn bennaf CDL, wedi cronni rhwng RC ac αβ-7 i αβ-13 (Ffigur 5, A a B). Mae lipidau a glanedyddion eraill sydd wedi'u datrys yn strwythurol wedi'u lleoli y tu allan i'r cylch LH1, ac mae cadwyni asyl sydd wedi'u datrys yn dda yn ymestyn rhwng is-unedau LH1, a ddynodwyd yn betrusgar fel β-DDM yn RC-LH114-W, ac a ddiffinnir fel β-DDM yn RC Cymysgedd o β-DDM a POPC-LH116. Mae safleoedd tebyg lipidau a glanedyddion chelating yn ein strwythur yn dangos eu bod yn safleoedd rhwymo perthnasol yn ffisiolegol (Ffigur S12A). Mae gan safleoedd moleciwlau cyfatebol yn Tch gysondeb da hefyd. Gentle a Trv. Dangosodd y straen 970 RC-LH1s (Ffigur S12, B i E) (9, 12) a gweddillion bondio hydrogen y grŵp pen lipid gadwraeth eithaf da yn yr aliniad dilyniant (Ffigur S13), sy'n dangos bod CDL wedi'i gadw sy'n rhwymo i RC (24), y gallai'r safleoedd hyn fod wedi'u cadw yn y cymhlyg RC-LH1.
(A a B) Cynrychiolir peptidau RC-LH114-W (A) ac RC-LH116 (B) gan gartwnau, a chynrychiolir y pigmentau gan wiail, gan ddefnyddio'r cynllun lliw yn Ffigur 1. Dangosir lipidau mewn coch, a dangosir glanedyddion mewn llwyd. Mae UQ wedi'i rwymo i safleoedd RC QA a QB yn felyn, tra bod UQ ynysig yn las. (C a D) Yr un golygfeydd â (A) a (B), gyda lipidau wedi'u hepgor. (E i G) Golygfa estynedig o Q1(E), Q2(F) a Q3(G) o RC-LH116, gyda chadwyni ochr sy'n dylanwadu ar ei gilydd. Dangosir y bondiau hydrogen fel llinellau toredig du.
Yn RC-LH116, mae RC QA a QB UQ, sy'n cymryd rhan mewn trosglwyddo electronau yn y broses gwahanu gwefr, wedi'u dadelfennu yn eu safleoedd rhwymo. Fodd bynnag, yn RC-LH114-W, nid yw cwinon QB wedi'i ddatrys a bydd yn cael ei drafod yn fanwl isod. Yn ogystal â chwinonau QA a QB, mae dau foleciwl UQ wedi'u cheleiddio (wedi'u lleoli rhwng y cylchoedd RC ac LH1) wedi'u dyrannu yn strwythur RC-LH114-W yn ôl eu grwpiau pen wedi'u datrys yn dda (wedi'u lleoli yn Q1 a Q2, yn y drefn honno). gofod). Ffigur 5C). Mae dau uned isopren wedi'u neilltuo i Q1, ac mae'r map dwysedd yn datrys y 10 cynffon isopren cyflawn o Q2. Yn strwythur RC-LH116, cafodd tri moleciwl UQ10 wedi'u cheleiddio (Q1 i Q3, Ffigur 5D) eu datrys, ac mae gan bob moleciwl ddwysedd clir drwy gydol y gynffon (Ffigur 5, D i G). Yn y ddau strwythur, mae gan safleoedd grwpiau pen cwinon Q1 a Q2 gysondeb rhagorol (Ffigur S12F), a dim ond ag RC y maent yn rhyngweithio. Mae Q1 wedi'i leoli wrth fynedfa bwlch W RC-LH114-W (Ffigur 1G a 5, C, D ac E), ac mae Q2 wedi'i leoli ger safle rhwymo QB (Ffigur 5, C, D) ac F). Mae'r gweddillion cadwedig L-Trp143 ac L-Trp269 yn agos iawn at Q1 a Q2 ac yn darparu rhyngweithiadau π-stacio posibl (Ffigur 5, E ac F, a Ffigur S12). Mae L-Gln88, 3.0 Å o ocsigen distal Q1, yn darparu bond hydrogen cryf (Ffigur 5E); mae'r gweddillion hwn wedi'u cadw ym mhob RC ac eithrio'r berthynas bellaf (Ffigur S13). Mae L-Ser91 wedi'i amnewid yn geidwadol ar gyfer Thr yn y rhan fwyaf o RCs eraill (Ffigur S13), mae'n 3.8 Angstrom o'r methyl ocsigen o Q1, a gall ddarparu bondiau hydrogen gwan (Ffigur 5E). Nid yw'n ymddangos bod gan Q3 ryngweithio penodol, ond mae wedi'i leoli yn y rhanbarth hydroffobig rhwng is-uned RC-M ac is-uned LH1-α 5 i 6 (Ffigur 5, D a G). Mae Q1, Q2 a Q3 neu gwinonau chelated cyfagos hefyd wedi'u datrys yn Tch. Gentle, Trv. Strain 970 a Blc. Mae strwythur yr iris (9, 10, 12) yn pwyntio at safle rhwymo cwinonau ategol cadwedig yn y cymhlyg RC-LH1 (Ffigur S12G). Mae'r pum UQ wedi'u dadelfennu yn RC-LH116 mewn cytundeb da â'r 5.8 ± 0.7 o bob cymhlyg a bennwyd gan gromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC), tra bod y tri UQ wedi'u dadelfennu yn RC-LH114-W yn is na'r gwerth a fesurwyd o 6.2 ± 0.3 (Ffig. S14) yn dangos bod moleciwlau UQ heb eu datrys yn y strwythur.
Mae pob polypeptid L ac M ffug-gymesur yn cynnwys pum TMH ac yn ffurfio heterodimer sy'n cyfuno un dimer BChl, dau monomer BChl, dau monomer bacterioffag (BPh), ac un haearn di-heme ac un neu ddau foleciwl UQ10. Trwy bresenoldeb bondiau hydrogen ar y grŵp ceton terfynol a'i groniad hysbys yn Rps, mae carotenoidau wedi'u hymgorffori yn yr is-uned M, a elwir yn cis-3,4-dehydroorhodopin. Rhywogaethau (25). Mae parth pilen allanol RC-H wedi'i angori i'r bilen gan un TMH. Mae strwythur cyffredinol yr RC yn debyg i'r tair is-uned RC o rywogaethau cysylltiedig (megis Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Mae macrogylchoedd BChl a BPh, asgwrn cefn carotenoid a haearn di-heme yn gorgyffwrdd o fewn ystod datrysiad y strwythurau hyn, fel y mae'r grŵp pen UQ10 yn y safle QA a'r cwinon QB yn RC-LH116 (Ffigur S15).
Mae argaeledd dau strwythur RC gyda chyfraddau meddiannaeth safle QB gwahanol yn rhoi cyfle newydd i archwilio'r newidiadau cyfluniadol cyson sy'n cyd-fynd â rhwymo cwinon QB. Yn y cymhlyg RC-LH116, mae cwinon QB wedi'i leoli yn y safle "proximal" wedi'i rwymo'n llawn (26), ond nid oes gan wahanu RC-LH114-W gwinon QB. Nid oes cwinon QB yn RC-LH114-W, sy'n syndod oherwydd bod y cymhlyg yn weithredol, yn fwy felly na'r cymhlyg RC-LH116 gyda chwinon QB wedi'i ddatrys yn strwythurol. Er bod y ddau gylch LH1 yn celatio tua chwe chwinon, mae pump wedi'u datrys yn strwythurol yn y cylch RC-LH116 caeedig, tra mai dim ond tri sydd wedi'u cyfyngu'n strwythurol yn y cylch RC-LH114-W agored. Gall yr anhwylder strwythurol cynyddol hwn adlewyrchu'r amnewid cyflymach o safleoedd QB RC-LH114-W, cineteg cwinon cyflymach yn y cymhlyg, a thebygolrwydd cynyddol o groesi'r ddolen LH1. Rydym yn awgrymu y gallai diffyg UQ yn safle RC QB RC-LH114-W fod yn ganlyniad i gymhleth mwy cymhleth a mwy gweithredol, ac mae safle QB RC-LH114-W wedi'i rewi ar unwaith yn y trosiant UQ. Mae'r cam penodol (mae'r fynedfa i safle QB wedi'i gau) yn adlewyrchu cyfluniad y gweithgaredd hwn.
Heb QB, mae cylchdro L-Phe217 yn mynd i safle sy'n anghydnaws â rhwymo UQ10, oherwydd bydd yn achosi gwrthdrawiad gofodol gydag uned isopren gyntaf y gynffon (Ffigur 6A). Yn ogystal, mae'r prif newidiadau cydymffurfiadol amlwg yn amlwg, yn enwedig yr helics de (helics byr yn y ddolen rhwng TMH D ac E) lle mae L-Phe217 wedi'i symud i'r poced rhwymo QB a chylchdro L-Tyr223 (Ffigur 6A) i dorri'r bond hydrogen gyda fframwaith M-Asp45 a chau mynedfa'r safle rhwymo QB (Ffigur 6B). Mae'r helics de yn troi wrth ei waelod, mae Cα L-Ser209 wedi'i symud 0.33Å, tra bod L-Val221Cα wedi'i symud 3.52Å. Nid oes unrhyw newidiadau gweladwy yn TMH D ac E, sy'n uwchben yn y ddau strwythur (Ffigur 6A). Hyd y gwyddom, dyma'r strwythur cyntaf yn yr RC naturiol sy'n cau'r safle QB. Mae cymhariaeth â'r strwythur cyflawn (wedi'i rwymo i QB) yn dangos, cyn i'r cwinon gael ei leihau, bod angen newid cyfluniadol i'w wneud yn mynd i mewn i'r cwinon. Mae L-Phe217 yn cylchdroi i ffurfio rhyngweithio π-stacio gyda'r grŵp pen cwinon, ac mae'r helics yn symud allan, gan ganiatáu i sgerbwd L-Gly222 a chadwyn ochr L-Tyr223 ffurfio rhwydwaith bond hydrogen gyda strwythur bond hydrogen sefydlog (Ffigur 6, A a C).
(A) Cartŵn sy'n gorgyffwrdd o hologram (cadwyn L, cadwyn oren/M, magenta) ac apo (llwyd), lle mae'r gweddillion allweddol yn cael eu harddangos ar ffurf cynrychiolaeth debyg i wialen. Cynrychiolir UQ10 gan far melyn. Mae'r llinell ddotiog yn dangos y bondiau hydrogen a ffurfiwyd yn y strwythur cyfan. (B a C) Cynrychiolaeth arwyneb yr apolipoprotein a'r strwythur cylch cyfan, gan amlygu ocsigen cadwyn ochr L-Phe217 mewn glas ac L-Tyr223 mewn coch, yn y drefn honno. Mae'r is-uned L yn oren; nid yw'r is-unedau M a H wedi'u lliwio. (D ac E) Safleoedd apolipoprotein (D) a (E) RC QB cyfan [lliwio yn ôl (A) yn y drefn honno] a Thermophilus thermophilus PSII (gwyrdd, glas gyda chwinon plastig; PDB ID: 3WU2) Alinio (58).
Yn annisgwyl, er bod sawl strwythur o RCs diffygiol o ran QB heb LH1 ar gael, nid yw'r newidiadau cyfluniadol a welwyd yn yr astudiaeth hon wedi'u hadrodd o'r blaen. Mae'r rhain yn cynnwys y strwythur disbyddu QB o Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) ac Rba. sphaeroides (ID PDB: 1OGV) (29), sydd i gyd bron yr un fath â'u strwythur QB cyffredinol. Datgelodd archwiliad manwl o 3PRC fod moleciwlau glanedydd LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) yn rhwymo wrth fynedfa'r safle QB, a all atal aildrefnu i gyfluniad caeedig. Er nad yw LDAO yn dadelfennu yn yr un safle yn 1EYS nac 1OGV, mae'r RCs hyn yn cael eu paratoi gan ddefnyddio'r un glanedydd ac felly gallant gynhyrchu'r un effaith. Strwythur crisial Rba. Mae'n ymddangos bod gan Sphaeroides RC wedi'i gyd-grisialu â cytochrome c2 (ID PDB: 1L9B) safle QB caeedig hefyd. Fodd bynnag, yn yr achos hwn, mae rhanbarth N-derfynol y polypeptid RC-M (sy'n rhyngweithio â'r safle rhwymo QB trwy'r bond H o'r gweddillion Tyr ar yr helics Q) yn mabwysiadu cyfluniad annaturiol, ac nid yw'r newid cyfluniadol QB yn cael ei archwilio ymhellach (30). Yr hyn sy'n galonogol yw nad ydym wedi gweld y math hwn o anffurfiad o'r polypeptid M yn strwythur RC-LH114-W, sydd bron yr un fath â rhanbarth N-derfynol RC-LH116 RC. Dylid nodi hefyd, ar ôl dileu'r antena LH1 sy'n seiliedig ar lanedydd, bod yr RCs apolipoprotein yn y PDB wedi'u datrys, a ddileodd y pyllau cwinon mewnol a'r lipidau yn y bwlch rhwng yr RC ac arwyneb mewnol y cylch LH1 o'i gwmpas (31, 32). Mae RC yn parhau i fod yn weithredol oherwydd ei fod yn cadw'r holl gyd-ffactorau, ac eithrio'r cwinon QB dadelfenadwy, sy'n llai sefydlog ac yn aml yn cael ei golli yn ystod y broses baratoi (33). Yn ogystal, gwyddys y gall tynnu LH1 a lipidau cylchol naturiol o RC gael effaith ar swyddogaethau, megis hyd oes byrrach y cyflwr P+QB sydd wedi'i wahanu gan wefr (31, 34, 35). Felly, rydym yn dyfalu y gallai bodolaeth y cylch LH1 lleol o amgylch yr RC gynnal y safle QB "caeedig", a thrwy hynny ddiogelu'r amgylchedd lleol ger y QB.
Er mai dim ond dau giplun o drosiant safle QB y mae apolipoprotein (heb gwinon QB) a'r strwythur cyflawn yn eu cynrychioli, yn hytrach na chyfres o ddigwyddiadau, mae arwyddion y gellir giatio'r rhwymiad i atal ail-rwymo gan hydrocwinon i atal ataliad swbstrad. Gall rhyngweithio cwinolol a chwinon ger safle QB apolipoprotein fod yn wahanol, sy'n arwain at ei wrthod gan RC. Mae wedi cael ei gynnig ers tro bod newidiadau cyfluniadol yn chwarae rhan yn rhwymo a lleihau cwinonau. Mae gallu RCs wedi'u rhewi i leihau cwinonau ar ôl addasu i'r tywyllwch wedi'i amharu (36); Mae crisialograffeg pelydr-X yn dangos bod y difrod hwn oherwydd bod cwinonau QB yn cael eu dal mewn cyfluniad "distal" tua 4.5 Å o'r safle proximal gweithredol (26), 37). Rydym yn awgrymu bod y cyfluniad rhwymo distal hwn yn giplun o'r cyflwr canolradd rhwng apolipoprotein a'r strwythur cylch llawn, sy'n dilyn y rhyngweithio cychwynnol â chwinon ac agoriad safle QB.
Mae gan y RC math II a geir yng nghyfadeilad PSII rhai bacteria ffototroffig a cyanobacteria, algâu a phlanhigion gadwraeth strwythurol a swyddogaethol (38). Mae'r aliniad strwythurol a ddangosir yn Ffigur 6 (D ac E) yn pwysleisio'r tebygrwydd rhwng RCs PSII a safle QB y cyfadeilad RC bacteriol. Mae'r gymhariaeth hon wedi bod yn fodel ers tro ar gyfer astudio'r systemau cysylltiedig agos o rwymo a lleihau cwinonau. Awgrymodd cyhoeddiadau blaenorol fod newidiadau cyfluniadol yn cyd-fynd â gostyngiad PSII o gwinonau (39, 40). Felly, o ystyried cadwraeth esblygiadol RC, gall y mecanwaith rhwymo hwn, nas gwelwyd o'r blaen, fod yn berthnasol hefyd i safle QB RC PSII mewn planhigion ffototroffig ocsigenedig.
Straeniau Rps ΔpufW (dileu pufW heb label) a PufW-His (protein-W wedi'i dagio â His 10x ar y C-derfynfa a fynegir o'r locus pufW naturiol). Disgrifiwyd palustris CGA009 yn ein gwaith blaenorol (16). Adferwyd y straeniau hyn a'r rhiant math gwyllt isogenig o'r rhewgell trwy roi nifer fach o gelloedd ar blât PYE (5 g litr yr un) (wedi'i storio mewn LB ar -80 °C, yn cynnwys 50% (w/v) glyserol) protein, dyfyniad burum a swcsinat) agar [1.5% (w/v)]. Deorwyd y plât dros nos yn y tywyllwch ar dymheredd ystafell o dan amodau anaerobig, ac yna ei oleuo â golau gwyn (~50 μmolm-2 s-1) a ddarparwyd gan fylbiau halogen OSRAM 116-W (RS Components, DU) am 3 i 5 diwrnod nes i un gytref ymddangos. Defnyddiwyd un gytref i frechu 10 ml o gyfrwng M22+ (41) wedi'i ategu â 0.1% (w/v) asidau casamino (y cyfeirir atynt o hyn ymlaen fel M22). Tyfwyd y diwylliant o dan amodau ocsigen isel yn y tywyllwch ar 34°C gan ysgwyd ar 180 rpm am 48 awr, ac yna brechwyd 70 ml o'r diwylliant o dan yr un amodau am 24 awr. Defnyddir diwylliant lled-aerobig gyda chyfaint o 1 ml i frechu 30 ml o gyfrwng M22 mewn potel wydr tryloyw â chap sgriw cyffredinol 30 ml a'i arbelydru â chynnwrf (~50μmolm-2 s-1) am 48 awr gan ddefnyddio gwialen gymysgu grym magnetig di-haint. Yna brechwyd 30 ml o'r diwylliant gyda thua 1 litr o ddiwylliant o dan yr un amodau, a ddefnyddiwyd wedyn i frechu tua 9 litr o ddiwylliant wedi'i oleuo ar ~200 μmolm-2 s-1 am 72 awr. Casglwyd y celloedd trwy allgyrchu ar 7132 RCF am 30 munud, eu hail-atal mewn ~10 ml o 20 mM tris-HCl (pH 8.0), a'u storio ar -20°C nes bod eu hangen.
Ar ôl dadmer, ychwanegwch rai crisialau o ddeoxyribonuclease I (Merck, DU), lysosym (Merck, DU) a dau dabled atalydd proteas holoenzyme Roche (Merck, DU) at y celloedd wedi'u hail-atal. Mewn cell bwysau Ffrengig 20,000 psi (Aminco, UDA), cafodd y celloedd eu torri 8 i 12 gwaith. Ar ôl tynnu celloedd heb eu torri a malurion anhydawdd trwy allgyrchu ar 18,500 RCF am 15 munud ar 4°C, cafodd y bilen ei waddodi o'r lysad pigmentog trwy allgyrchu ar 113,000 RCF am 2 awr ar 43,000°C. Taflwch y ffracsiwn hydawdd ac ail-ataliwch y bilen lliw mewn 100 i 200 ml o 20 mM tris-HCl (pH 8.0) a homogeneiddiwch nes nad oes unrhyw agregau gweladwy. Cafodd y bilen ataliedig ei magu mewn 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, UDA) yn cynnwys 2% (w/v) β-DDM am 1 awr yn y tywyllwch ar 4°C gan ei droi'n ysgafn. Yna ei centrifugio ar 70°C i doddi 150,000 RCF ar 4°C am 1 awr i gael gwared ar weddillion anhydawdd.
Cymhwyswyd y bilen hydoddi o'r straen ΔpufW i golofn cyfnewid ïonau DEAE Sepharose 50 ml gyda thri chyfaint colofn (CV) o glustog rhwymo [20 mM tris-HCl (pH 8.0) yn cynnwys 0.03% (w / v) β-DDM]. Golchwch y golofn gyda dau glustog rhwymo CV, ac yna golchwch y golofn gyda dau glustog rhwymo yn cynnwys 50 mM NaCl. Elwiwyd y cymhlyg RC-LH116 gyda graddiant llinol o 150 i 300 mM NaCl (mewn glustog rhwymo) ar 1.75 CV, ac elwiwyd y cymhlyg rhwymo sy'n weddill gyda chlustog rhwymo yn cynnwys 300 mM NaCl ar 0.5 CV. Casglwch y sbectrwm amsugno rhwng 250 a 1000 nm, cadwch y ffracsiwn gyda chymhareb amsugnedd (A880/A280) yn fwy nag 1 ar 880 i 280 nm, gwanhewch ef ddwywaith yn y byffer rhwymo, a defnyddiwch yr un weithdrefn eto ar y golofn DEAE Ar buro. Gwanhewch y ffracsiynau gyda chymhareb A880/A280 yn uwch nag 1.7 a chymhareb A880/A805 yn uwch na 3.0, perfformiwch y drydedd rownd o gyfnewid ïonau, a chadwch ffracsiynau gyda chymhareb A880/A280 yn uwch na 2.2 a chymhareb A880/A805 yn uwch na 5.0. Crynodiad y cymhlyg wedi'i buro'n rhannol i ~2 ml mewn hidlydd allgyrchol torbwynt pwysau moleciwlaidd Amicon 100,000 (MWCO) (Merck, DU), a'i lwytho ar golofn eithrio maint Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, UDA) yn cynnwys byffer NaCl 200 mM, ac yna ei elwtio yn yr un byffer ar 1.5 CV. Casglwch sbectrwm amsugno'r ffracsiwn eithrio maint, a chrynodiad y sbectrwm amsugno gyda chymharebau A880/A280 dros 2.4 a chymharebau A880/A805 dros 5.8 i 100 A880, a'u defnyddio ar unwaith ar gyfer paratoi neu storio grid cryo-TEM. Cadwch ar -80°C nes bod ei angen.
Cymhwyswyd y bilen hydoddi o'r straen PufW-His i golofn Sepharose HisPrep FF Ni-NTA 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) yn cynnwys 200 mM NaCl a 0.03% (w/w)) mewn byffer IMAC (GE Healthcare). (v) β-DDM]. Golchwyd y golofn gyda phum CV o fyffer IMAC, ac yna gyda phum CV o fyffer IMAC yn cynnwys 10 mM histidin. Elwiwyd y cymhlyg craidd o'r golofn gyda phum byffer IMAC yn cynnwys 100 mM histidin. Crynodir y ffracsiwn sy'n cynnwys y cymhlyg RC-LH114-W i ~10 ml mewn tanc wedi'i droi sydd â hidlydd Amicon 100,000 MWCO (Merck, DU), ei wanhau 20 gwaith gyda byffer rhwymo, ac yna ei ychwanegu at 25 ml. Yng ngholofn Sepharose DEAE, defnyddir pedwar CV wedi'u rhwymo i'r byffer ymlaen llaw. Golchwch y golofn gyda phedwar byffer rhwymo CV, yna elwtiwch y cymhlyg ar wyth CV ar raddiant llinol o 0 i 100 mM NaCl (mewn byffer rhwymo), a'r pedwar CV sy'n weddill yn cynnwys byffer rhwymo 100 mM. Crynhowyd y cymhlygion gweddilliol a elwtiwyd ar y sodiwm clorid ynghyd â'r gymhareb A880/A280 yn uwch na 2.4 a'r gymhareb A880/A805 yn uwch na 4.6 o ffracsiynau i ~2 ml mewn hidlydd allgyrchol Amicon 100,000 MWCO, a'u llenwi ag IMAC 1.5 CV ymlaen llaw. Colofn eithrio maint Superdex 200 16/600 wedi'i chydbwyso â byffer, ac yna eu elwtiwch yn yr un byffer dros 1.5 CV. Casglwch y sbectrwm amsugno o'r ffracsiynau gwahardd maint a chrynodiad y sbectrwm amsugno gyda chymhareb A880/A280 dros 2.1 a chymhareb A880/A805 dros 4.6 i 100 A880, a ddefnyddir ar unwaith ar gyfer paratoi grid TEM wedi'i rewi neu a storir ar -80°C tan y bydd eu hangen.
Defnyddiwyd rhewgell trochi Leica EM GP i baratoi gridiau TEM tymheredd isel. Cafodd y cymhlyg ei wanhau mewn byffer IMAC i A880 o 50, ac yna llwythwyd 5μl ar rwyll copr wedi'i gorchuddio â charbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 newydd ei rhyddhau'n tywynnu (Agar Scientific, DU). Deorwch y grid ar 20°C a 60% o leithder cymharol am 30 eiliad, yna ei sychu'n sych am 3 eiliad, ac yna ei ddiffodd mewn ethan hylif ar -176°C.
Cofnodwyd data'r cyfadeilad RC-LH114-W ar yr eBIC (Canolfan Biodelweddu Electronig) (Ffynhonnell Golau Diemwnt Prydain) gyda microsgop Titan Krios, sy'n gweithio ar foltedd cyflymu o 300kV, gyda chwyddiad enwol o 130,000× ac egni o - Dewiswch fwlch o 20 eV. Defnyddiwyd Gatan 968 GIF Quantum gyda synhwyrydd brig K2 i gofnodi delweddau yn y modd cyfrif i gasglu data. Maint y picsel wedi'i galibro yw 1.048Å, a'r gyfradd dos yw 3.83 e-Å-2s-1. Casglwyd y ffilm mewn 11 eiliad a'i rhannu'n 40 rhan. Defnyddiwch yr ardal wedi'i gorchuddio â charbon i ailffocysu'r microsgop, ac yna casglwch dair ffilm fesul twll. At ei gilydd, casglwyd 3130 o ffilmiau, gyda gwerthoedd dadffocysu rhwng -1 a -3μm.
Casglwyd y data ar gyfer y cymhlyg RC-LH116 gan ddefnyddio'r un microsgop yn Labordy Biostrwythur Asterbury (Prifysgol Leeds, DU). Casglwyd y data mewn modd cyfrif gyda chwyddiad o 130 k, a chalibrwyd maint y picsel i 1.065 Å gyda dos o 4.6 e-Å-2s-1. Recordiwyd y ffilm mewn 12 eiliad a'i rhannu'n 48 rhan. At ei gilydd, casglwyd 3359 o ffilmiau, gyda gwerthoedd dadffocws rhwng -1 a -3μm.
Mae'r holl brosesu data yn cael ei wneud yn y biblinell Relion 3.0 (42). Defnyddiwch Motioncorr 2 (43) i gywiro symudiad y trawst trwy bwysoli dos, ac yna defnyddiwch CTFFIND 4.1 (44) i bennu'r paramedr CTF (swyddogaeth trosglwyddo cyferbyniad). Dangosir ffotomicrograffau nodweddiadol ar ôl y camau prosesu cychwynnol hyn yn Ffigur 2. S16. Cynhyrchir y templed dewis awtomatig trwy ddewis â llaw tua 250 picsel o 1000 o ronynnau mewn ffrâm 250 picsel a dim dosbarthiad dwy ddimensiwn (2D) cyfeirio, a thrwy hynny wrthod y dosbarthiadau hynny sy'n bodloni halogiad sampl neu nad oes ganddynt unrhyw nodweddion amlwg. Yna, perfformiwyd dewis awtomatig ar yr holl ficroffotograffau, ac roedd yr RC-LH114-W yn 849,359 o ronynnau, ac roedd y cymhlyg RC-LH116 yn 476,547 o ronynnau. Mae'r holl ronynnau a ddewiswyd wedi cael dwy rownd o ddosbarthiad 2D di-gyfeirio, ac ar ôl pob rhediad, mae'r gronynnau sy'n bodloni'r ardal carbon, halogiad sampl, dim nodweddion amlwg neu ronynnau sy'n gorgyffwrdd yn gryf yn cael eu gwrthod, gan arwain at 772,033 (90.9%) a 359,678 (75.5%). Defnyddir gronynnau ar gyfer dosbarthu 3D RC-LH114-W ac RC-LH116 yn y drefn honno. Cynhyrchwyd y model cyfeirio 3D cychwynnol gan ddefnyddio'r dull disgyniad graddiant stocastig. Gan ddefnyddio'r model cychwynnol fel cyfeirnod, mae'r gronynnau a ddewiswyd yn cael eu dosbarthu i bedwar categori mewn 3D. Gan ddefnyddio'r model yn y categori hwn fel cyfeirnod, perfformiwch fireinio 3D ar y gronynnau yn y categori mwyaf, yna defnyddiwch yr hidlydd pasio isel 15Å cychwynnol i orchuddio'r ardal toddydd, ychwanegwch 6 picsel o ymylon meddal, ac ôl-broseswch y picseli i gywiro swyddogaeth trosglwyddo Modwleiddio brig Gatan K2 y synhwyrydd uchaf. Ar gyfer y set ddata RC-LH114-W, addaswyd y model cychwynnol hwn trwy gael gwared ar y dwysedd cryf ar ymylon y mwgwd (wedi'i ddatgysylltu o ddwysedd cymhleth y craidd yn Chimera UCSF). Defnyddir y modelau canlyniadol (mae datrysiadau RC-LH114-W ac RC-LH116 yn 3.91 a 4.16 Å, yn y drefn honno) fel cyfeiriad ar gyfer yr ail rownd o ddosbarthu 3D. Mae'r gronynnau a ddefnyddir wedi'u grwpio i'r dosbarth 3D cychwynnol ac nid ydynt yn cynnwys cydberthynas gref â'r gymdogaeth. Gorgyffwrdd neu ddiffyg nodweddion strwythurol amlwg. Ar ôl yr ail rownd o ddosbarthu 3D, dewiswyd y categori gyda'r datrysiad uchaf [Ar gyfer RC-LH114-W, un categori yw 377,703 o ronynnau (44.5%), ar gyfer RC-LH116, mae dau gategori, cyfanswm o 260,752 o ronynnau (54.7%), lle maent yr un peth dim ond pan gânt eu halinio ar ôl y cylchdro cychwynnol gyda gwahaniaeth bach]. Caiff y gronynnau a ddewiswyd eu hail-echdynnu mewn blwch 400 picsel a'u mireinio trwy fireinio 3D. Cynhyrchir y mwgwd toddydd gan ddefnyddio'r hidlydd pasio isel 15Å cychwynnol, ehangu map 3 picsel a mwgwd meddal 3 picsel. Gan ddefnyddio mireinio CTF fesul gronyn, cywiro symudiad fesul gronyn a'r ail rownd o fireinio CTF fesul gronyn, perfformir mireinio 3D, masgio toddydd ac ôl-brosesu ar ôl pob cam i fireinio'r gwead canlyniadol ymhellach. Gan ddefnyddio gwerth torri FSC (Cyfernod Cydberthynas Cragen Fourier) o 0.143, mae datrysiadau modelau terfynol RC-LH114-W ac RC-LH116 yn 2.65 a 2.80Å, yn y drefn honno. Dangosir cromlin FSC y model terfynol yn Ffigur 2. S17.
Mae pob dilyniant protein wedi'i lawrlwytho o UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Defnyddiwyd SWISS-MODEL (45) i lunio model homologi o RC, sy'n cynnwys dilyniannau protein RC-L, RC-M ac RC-H a strwythur crisial Rba. Defnyddiwyd sphaeroides RC fel templed (PDB ID: 5LSE) (46). Defnyddiwch yr offeryn “map ffitio” yn UCSF Chimera i ffitio’r model a gynhyrchwyd i’r map (47), gwella strwythur y protein, a defnyddiwch Coot (48) i ychwanegu’r cydffactor [4×BChl a (enw gweddillion llyfrgell monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), un neu ddau fath o UQ10 (U10), un haearn di-heme (Fe) ac un 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)]. Gan nad yw QAK ar gael yn llyfrgell y monomer, cafodd ei baramedroli gan ddefnyddio’r offeryn eLBOW yn PHENIX (49).
Nesaf, adeiladwyd yr is-uned LH1. I ddechrau, defnyddiwyd yr offeryn adeiladu awtomatig yn PHENIX (49) i adeiladu rhan o'r dilyniant LH1 yn awtomatig gan ddefnyddio'r map a'r dilyniannau protein LH1-α ac LH1-β fel mewnbwn. Dewiswch yr is-uned LH1 fwyaf cyflawn, ei dynnu allan a'i llwytho i mewn i Coot, ychwanegwch y dilyniant coll ynddo â llaw, a mireinio'r strwythur cyfan â llaw cyn ychwanegu dau BCls a (BCL) a spirilloxanthin (CRT) [yn ôl yr Rps perthnasol Dwysedd y cymhlyg LH1 a'r cynnwys carotenoid hysbys. Rhywogaethau (17)]. Copïwch yr is-uned LH1 gyflawn, a defnyddiwch "Offeryn Map Docio" Chimera UCSF i docio yn yr ardal gyfagos nad yw'n fodel o ddwysedd LH1, ac yna ei mireinio yn Coot; ailadroddwch y broses nes bod pob is-uned LH1 wedi'i modelu. Ar gyfer strwythur RC-LH114-W, trwy echdynnu'r dwysedd heb ei ddyrannu yn y Coot, caiff y protein ei segmentu o'r cydrannau di-brotein sy'n weddill ym map Chimera USCF a defnyddir yr offeryn Autobuild i sefydlu'r model cychwynnol, a'r is-unedau sy'n weddill (protein-W) Modelu. Yn PHENIX (49). Ychwanegwch unrhyw ddilyniannau coll at y model sy'n deillio o hyn yn Coot (48), ac yna mireinio'r is-uned gyfan â llaw. Mae'r dwysedd heb ei ddyrannu sy'n weddill yn ffitio'r cyfuniad o lipidau (ID llyfrgell monomer PDB o CDL = CDL, POPC = 6PL a POPG = PGT), glanedydd β-DDM (LMT) a moleciwlau UQ10 (U10). Defnyddiwch optimeiddio PHENIX (49) ac optimeiddio â llaw yn Coot (48) i berffeithio'r model cychwynnol cyflawn nes na ellir gwella ystadegau'r model ac ansawdd gweledol y ffit ymhellach. Yn olaf, defnyddiwch LocScale (50) i hogi'r map lleol, ac yna perfformiwch sawl cylch arall o fodelu'r dwysedd heb ei ddyrannu ac optimeiddio awtomatig a â llaw.
Dangosir y peptidau, y cyd-ffactorau a'r lipidau a'r cwinonau eraill wedi'u docio o fewn eu dwyseddau priodol yn Ffigurau 1 a 2. S18 i S23. Dangosir y wybodaeth ystadegol am y model terfynol yn Nhabl S1.
Oni nodir yn wahanol, casglwyd y sbectrwm amsugno UV/Vis/NIR ar sbectroffotomedr Cary60 (Agilent, UDA) ar gyfnodau o 1 nm o 250 nm i 1000 nm ac amser integreiddio o 0.1 eiliad.
Gwanhewch y sampl mewn ciwfed cwarts gyda llwybr 2 mm i A880 o 1, a chasglwch y sbectrwm amsugno rhwng 400 a 1000 nm. Casglwyd y sbectrwm dichroig crwn ar sbectropolarimedr Jasco 810 (Jasco, Japan) ar gyfnodau o 1 nm rhwng 400 nm a 950 nm ar gyfradd sganio o 20 nm mun-1.
Pennir y cyfernod difodiant molar trwy wanhau'r cymhlyg craidd i A880 o tua 50. Gwanhewch y gyfaint 10μl mewn byffer rhwymo 990μl neu fethanol, a chasglwch y sbectrwm amsugno ar unwaith i leihau diraddio BChl. Cyfrifwyd cynnwys BChl pob sampl methanol gan y cyfernod difodiant ar 771 nm o 54.8 mM-1 cm-1, a phennwyd y cyfernod difodiant (51). Rhannwch y crynodiad BChl a fesurwyd â 32 (RC-LH114-W) neu 36 (RC-LH116) i bennu crynodiad y cymhlyg craidd, a ddefnyddir wedyn i bennu sbectrwm amsugno'r un sampl a gasglwyd yn y byffer Cyfernod Difodiant. Cyfochrog. Cymerwyd tri mesuriad ailadroddus ar gyfer pob sampl, a defnyddiwyd amsugnedd cyfartalog uchafswm Qy BChl ar gyfer cyfrifo. Cyfernod difodiant RC-LH114-W wedi'i fesur ar 878 nm yw 3280±140 mM-1 cm-1, tra bod cyfernod difodiant RC-LH116 wedi'i fesur ar 880 nm yn 3800±30 mM-1 cm-1.
Mesurwyd UQ10 yn ôl y dull yn (52). Yn gryno, perfformiwyd HPLC cam gwrthdro (RP-HPLC) gan ddefnyddio'r system HPLC Agilent 1200. Toddwch tua 0.02 nmol o RC-LH116 neu RC-LH114-W mewn 50μl o fethanol:clorofform 50:50 sy'n cynnwys 0.02% (w/v) clorid fferrig, a chwistrellwch y Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm wedi'i gydbwyso ymlaen llaw. Toddwch mewn 1 ml-1 mun-1 ar 40°C mewn toddydd HPLC (80:20 methanol:2-propanol) ar golofn ×25 cm. Perfformiwch elution isocrataidd mewn toddydd HPLC i fonitro amsugnedd ar 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoidau) a 780 nm (BChl) am 1 awr. Integreiddiwyd y brig yn y cromatogram 275 nm ar ôl 25.5 munud, ac nid oedd yn cynnwys unrhyw gyfansoddion canfyddadwy eraill. Defnyddir yr arwynebedd integredig i gyfrifo'r swm molar o UQ10 a echdynnwyd gan gyfeirio at y gromlin calibradu a gyfrifwyd o chwistrelliad safonau pur o 0 i 5.8 nmol (Ffigur S14). Dadansoddwyd pob sampl mewn tair dyblygiad, ac mae'r gwall a adroddwyd yn cyfateb i'r SD o'r cyfartaledd.
Paratowyd toddiant yn cynnwys y cymhlyg RC-LH1 gydag amsugniad Qy mwyaf o 0.1 gyda 30 μM o cytochrome c2 calon ceffyl wedi'i leihau (Merck, DU) a 0 i 50 μMUQ2 (Merck, DU). Paratowyd tri sampl 1-ml ym mhob crynodiad UQ2 a'u magu dros nos yn y tywyllwch ar 4°C i sicrhau addasiad llwyr i'r tywyllwch cyn mesur. Llwythwyd yr toddiant i mewn i sbectroffotomedr modiwlaidd OLIS RSM1000 wedi'i gyfarparu â grat fflam/llinell 500 300 nm, mewnfa 1.24 mm, canol 0.12 mm ac allfa 0.6 mm. Gosodwyd hidlydd pasio 600 nm o hyd wrth fynedfa'r ffotodiwb sampl a'r tiwb ffotoluosogydd cyfeirio i eithrio golau cyffroi. Monitrwyd yr amsugnedd ar 550 nm gydag amser integreiddio o 0.15 eiliad. Mae'r golau cyffroi yn cael ei allyrru o'r LED M880F2 880 nm (Deuod Allyrru Golau) (Thorlabs Ltd., DU) trwy gebl ffibr optig ar ddwyster o 90% trwy reolydd DC2200 (Thorlabs Ltd., DU) ac yn cael ei allyrru i'r ffynhonnell golau ar ongl o 90°. Mae'r trawst mesur yn gwrthwynebu'r drych i ddychwelyd unrhyw olau nad oedd wedi'i amsugno gan y sampl i ddechrau. Monitro'r amsugnedd 10 eiliad cyn y goleuedd o 50 eiliad. Yna monitrwyd yr amsugnedd ymhellach am 60 eiliad yn y tywyllwch i asesu'r graddau y mae cwinolool yn lleihau cytochrome c23+ yn ddigymell (gweler Ffigur S8 am ddata crai).
Proseswyd y data drwy ffitio cyfradd gychwynnol llinol o fewn 0.5 i 10 eiliad (yn dibynnu ar grynodiad UQ2) a chyfartaleddu cyfraddau'r tri sampl ym mhob crynodiad UQ2. Defnyddiwyd y crynodiad RC-LH1 a gyfrifwyd gan y cyfernod difodiant priodol i drosi'r gyfradd yn effeithlonrwydd catalytig, a blotiwyd yn Origin Pro 2019 (OriginLab, UDA), a'i ffitio i'r model Michaelis-Menten i bennu'r gwerthoedd Km a Kcat ymddangosiadol.
Ar gyfer mesuriadau amsugno dros dro, cafodd y sampl RC-LH1 ei wanhau i ~2μM mewn byffer IMAC yn cynnwys 50 mM sodiwm ascorbat (Merck, UDA) a 0.4 mM Terbutin (Merck, UDA). Defnyddir asid ascorbig fel rhoddwr electronau aberthol, a defnyddir tert-butaclofen fel atalydd QB i sicrhau bod y prif roddwr RC yn parhau i gael ei leihau (hynny yw, heb ei ffotoocsideiddio) drwy gydol y broses fesur. Ychwanegir tua 3 ml o sampl at gell gylchdroi bwrpasol (tua 0.1 m mewn diamedr, 350 RPM) gyda hyd llwybr optegol o 2 mm i sicrhau bod gan y sampl yn y llwybr laser ddigon o amser i addasu i'r tywyllwch rhwng pylsau cyffroi. Defnyddiwch bylsau laser ~100-fs i fwyhau'r system laser Ti:Sapphire (Spectra Physics, UDA) i gyffroi'r sampl ar 880 nm ar gyfradd ailadrodd o 1 kHz (20 nJ ar gyfer NIR neu 100 nJ ar gyfer Vis). Cyn casglu data, amlygwch y sampl i olau cyffroi am tua 30 munud. Bydd amlygiad yn achosi anactifadu QA (gan leihau QA unwaith neu ddwy o bosibl). Ond nodwch fod y broses hon yn gildroadwy oherwydd ar ôl cyfnod hir o addasu i'r tywyllwch, bydd RC yn dychwelyd yn araf i weithgaredd QA. Defnyddiwyd sbectromedr Helios (Ultrafast Systems, UDA) i fesur sbectrwm dros dro gydag amser oedi o -10 i 7000 ps. Defnyddiwch feddalwedd Surface Xplorer (Ultrafast Systems, UDA) i ddadgrwpio'r setiau data, yna eu cyfuno a'u safoni. Defnyddiwch y pecyn meddalwedd CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithwania) i ddefnyddio'r set ddata gyfunol i gael sbectrwm gwahaniaethol sy'n gysylltiedig â dadfeiliad, neu defnyddiwch ffwythiant sy'n cyfuno esbonyddion lluosog gydag ymateb yr offeryn i ffitio'r esblygiad sbectrol tonfedd sengl yn Origin (OriginLab, UDA).
Fel y soniwyd uchod (53), paratowyd ffilm ffotosynthetig yn cynnwys cymhlyg LH1 heb antena RC na'r antena LH2 ymylol. Cafodd y bilen ei gwanhau mewn 20 mM tris (pH 8.0) ac yna ei llwytho i mewn i giwfed cwarts gyda llwybr optegol 2 mm. Defnyddiwyd pwls laser 30nJ i gyffroi'r sampl ar 540 nm gydag amser oedi o -10 i 7000 ps. Proseswch y set ddata fel y disgrifiwyd ar gyfer sampl Rps. pal.
Cafodd y bilen ei phelennu drwy allgyrchu ar 150,000 RCF am 2 awr ar 4°C, ac yna cafodd ei amsugnedd ar 880 nm ei ail-atal mewn 20 mM tris-HCl (pH 8.0) a 200 mM NaCl. Toddwch y bilen drwy ei throi'n araf mewn 2% (w/v) β-DDM am 1 awr yn y tywyllwch ar 4°C. Cafodd y sampl ei wanhau mewn 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, DU) i grynodiad protein o 2.5 mg ml-1 (dadansoddiad Bio-Rad). Cynhaliwyd prosesu pellach o'r dull a gyhoeddwyd yn flaenorol (54), gan ddechrau gyda gwanhau 50 μg o brotein i gyfanswm o 50 μl o TEAB yn cynnwys 1% (w/v) sodiwm laurate (Merck, DU). Ar ôl sonication am 60 eiliad, cafodd ei leihau gyda 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, DU) ar 37°C am 30 munud. Ar gyfer S-alkylation, deorwch y sampl gyda 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, DU) a'i ychwanegu o doddiant stoc isopropanol 200 mM am 10 munud ar dymheredd ystafell. Cynhaliwyd treuliad proteolytig trwy ychwanegu 2 μg o gymysgedd trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega DU) a'i ddeori ar 37°C am 3 awr. Echdynnwyd y syrffactydd laurate trwy ychwanegu 50 μl o asetad ethyl a 10 μl o asid trifluoroacetig gradd LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, DU) a'i fortecsio am 60 eiliad. Hyrwyddwyd y gwahanu cyfnodau trwy allgyrchu ar 15,700 RCF am 5 munud. Yn ôl protocol y gwneuthurwr, defnyddiwyd colofn nyddu C18 (Thermo Fisher Scientific, DU) i sugno a dadhalenu'r cyfnod isaf yn ofalus sy'n cynnwys y peptid. Ar ôl sychu trwy allgyrchu gwactod, diddymwyd y sampl mewn 0.5% TFA a 3% asetonitril, a dadansoddwyd 500 ng trwy gromatograffaeth nanoflow RP ynghyd â sbectrometreg màs gan ddefnyddio paramedrau'r system a fanylwyd yn flaenorol.
Defnyddiwch MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ar gyfer adnabod a meintioli proteinau i chwilio am gronfa ddata proteome Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Mae'r data proteomeg sbectrometreg màs wedi'i adneuo yn y ProteomeXchange Alliance trwy'r storfa bartner PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) o dan y dynodwr set ddata PXD020402.
Ar gyfer dadansoddi gan RPLC ynghyd â sbectrometreg màs ïoneiddio electrochwistrellu, paratowyd y cymhlyg RC-LH1 o Rps math gwyllt. Gan ddefnyddio'r dull a gyhoeddwyd yn flaenorol (16), roedd y crynodiad protein a gynhyrchwyd mewn celloedd palustris yn 2 mg ml-1 mewn 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl a 0.03% (w/v) β- (dadansoddiad Bio-Rad)) DDM. Yn ôl protocol y gwneuthurwr, defnyddiwch becyn puro 2D (GE Healthcare, UDA) i echdynnu 10 μg o brotein trwy'r dull gwaddodiad, a diddymu'r gwaddod mewn 20 μl o asid fformig (FA) 60% (v/v), 20% (v/v) asetonitrile a 20% (v/v) dŵr. Dadansoddwyd pum microlitr gan RPLC (Dionex RSLC) ynghyd â sbectrometreg màs (Maxis UHR-TOF, Bruker). Defnyddiwch golofn MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, DU) ar gyfer gwahanu ar 60°C a 100μlmin -1, gyda graddiant o 85% (v / v) o doddydd A [0.1% (v / v) FA a 0.02% (V/v) hydoddiant dyfrllyd TFA] i 85%(v/v) o doddydd B [0.1%(v/v) FA a 0.02%(v/v) mewn 90%(v/v) asetonitril TFA]. Gan ddefnyddio ffynhonnell ïoneiddio electrochwistrellu safonol a pharamedrau diofyn am fwy na 60 munud, mae'r sbectromedr màs yn cael 100 i 2750 m/z (cymhareb màs-i-wefr). Gyda chymorth porth adnoddau biowybodeg ExPASy, offeryn FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), mapio'r sbectrwm màs i is-unedau'r cymhlyg.
Tyfwyd y celloedd am 72 awr o dan olau 100 ml NF-isel (10μMm-2 s-1), canolig (30μMm-2 s-1) neu uchel (300μMm-2 s-1). Cyfrwng M22 (cyfrwng M22 lle mae amoniwm sylffad wedi'i hepgor a sodiwm swcsinat wedi'i ddisodli gan sodiwm asetat) mewn potel sgriw-gaead 100 ml (23). Mewn pum cylch 30 eiliad, gleiniwyd gleiniau gwydr 0.1 micron ar gymhareb gyfaint o 1:1 i lysu'r celloedd a'u hoeri ar rew am 5 munud. Tynnwyd y mater anhydawdd, celloedd heb eu torri a gleiniau gwydr trwy allgyrchu ar 16,000 RCF am 10 munud mewn microganrifug bench. Gwahanwyd y bilen mewn rotor Ti 70.1 gyda 100,000 RCF mewn 20 mM tris-HCl (pH 8.0) gyda graddiant swcros 40/15% (w/w) am 10 awr.
Fel y disgrifiwyd yn ein gwaith blaenorol, imiwnoddetegu'r tag His ar PufW (16). Yn gryno, cafodd y cymhlyg craidd wedi'i buro (11.8 nM) neu'r bilen sy'n cynnwys yr un crynodiad o RC (a bennwyd trwy ocsideiddio gan dynnu'r sbectrwm gwahaniaeth gostyngedig a chyfateb y llwyth ar y gel wedi'i staenio) mewn byffer llwytho 2x SDS (Merck, DU) ei wanhau ddwywaith. Gwahanwyd y proteinau ar gel bis-tris NuPage replica 12% (Thermo Fisher Scientific, DU). Staeniwyd gel â Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, DU) i lwytho a delweddu'r is-uned RC-L. Trosglwyddwyd y protein ar yr ail gel i bilen polyfinylidene fflworid wedi'i actifadu gan methanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, DU) ar gyfer imiwnoasai. Cafodd y bilen PVDF ei blocio mewn 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 a 5% (w / v) powdr llaeth sgim, ac yna ei ddeori gyda'r gwrthgorff cynradd gwrth-His (mewn Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl a 0.05% (v/v) Tween-20] mewn 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, UDA) am 4 awr. Ar ôl golchi 3 gwaith am 5 munud mewn byffer gwrthgorff, cyfunwyd y bilen â gwrthgorff eilaidd gwrth-lygoden perocsidase marchruddygl (Sigma-Aldrich, DU) (wedi'i wanhau 1:10,000 mewn byffer gwrthgorff). Deorwch i ganiatáu canfod (5 munud ar ôl 3 golchiad mewn byffer gwrthgorff) gan ddefnyddio swbstrad cemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, yr Eidal) ac Amersham Imager 600 (GE Healthcare, DU).
Drwy luniadu dosbarthiad dwyster pob gel wedi'i staenio neu lôn imiwnoasai, integreiddio'r arwynebedd o dan y brig a chyfrifo cymhareb dwyster RC-L (gel wedi'i staenio) a Protein-W (imiwnoasai), yn ImageJ (57) Proseswch y ddelwedd. Troswyd y cymharebion hyn yn gymharebion molar drwy dybio bod cymhareb RC-L i brotein-W yn y sampl RC-LH114-W pur yn 1:1 a normaleiddio'r set ddata gyfan yn unol â hynny.
Am ddeunyddiau atodol ar gyfer yr erthygl hon, gweler http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Mae hon yn erthygl mynediad agored a ddosberthir o dan delerau'r Drwydded Priodoliad Creative Commons. Mae'r erthygl yn caniatáu defnydd, dosbarthiad ac atgynhyrchu heb gyfyngiad mewn unrhyw gyfrwng ar yr amod bod y gwaith gwreiddiol wedi'i ddyfynnu'n gywir.
Nodyn: Dim ond gofynnwn i chi ddarparu eich cyfeiriad e-bost fel bod y person rydych chi'n ei argymell i'r dudalen yn gwybod eich bod chi eisiau iddyn nhw weld yr e-bost ac nad sbam ydyw. Ni fyddwn yn casglu unrhyw gyfeiriadau e-bost.
Defnyddir y cwestiwn hwn i brofi a ydych chi'n ymwelydd ac atal cyflwyno sbam yn awtomatig.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Mae strwythur cydraniad uchel y cymhlyg trap golau 1 yng nghanolfan yr adwaith yn rhoi cipolwg newydd ar ddeinameg y cwinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Mae strwythur cydraniad uchel y cymhlyg trap golau 1 yng nghanolfan yr adwaith yn rhoi cipolwg newydd ar ddeinameg y cwinon.
©2021 Cymdeithas America er Hyrwyddo Gwyddoniaeth. cedwir pob hawl. Mae AAAS yn bartner i HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. GwyddoniaethAdvances ISSN 2375-2548.